Этот протокол является очень простым и эффективным способом обнаружения мутантов, генерируемых технологией CRISPR / Cas9 от многочисленных людей. Два основных преимущества этой техники заключаются в том, что ее можно сделать за несколько часов и что она применима к множеству организмов. Дизайн грунтовки может быть сложным для определенных генов, и для повышения эффективности HRMA может потребоваться несколько раундов проектирования и проверки праймера.
Чтобы выполнить градиентную ПЦР, начните с приготовления мастер-микса. Затем удалите 19 микролитров мастер-микса для нешаблонного контроля или NTC в 96-луночной пластине. Затем добавьте шаблон в оставшийся мастер-микс.
Aliquot 20 микролитров образца смешивают в 96-луночную пластину. Выполните ПЦР, следуя параметрам цикла, а затем сгенерируйте профили термического расплава, используя параметры, упомянутые в рукописи. После сбора всего необходимого материала подготовьте мастер-микс с 0,5 микролитрами реагента высвобождения ДНК и 20 микролитрами буфера разбавления на человека, подлежащего генотипированию.
Используя многоканальную пипетку, аликвотировать 20 микролитров смеси в ПЦР-пластину и оставить ПЦР-пластину на льду. Затем поместите обезболенных комаров G1 в стеклянную чашку Петри, чтобы держать их седативными, и поместите восемь комаров дикого типа во вторую чашку Петри. Протрите пару пинцетов 70% этанолом и используйте продезинфицированный пинцет, чтобы удалить одну из задних лап комаров.
Затем погружают ножку в раствор реагента высвобождения ДНК. Поместите комара в соответствующий флакон и закройте флакон губкой. После этого протрите пинцет 70% этанолом, прежде чем приступить к удалению ноги от следующего комара, пока не будет завершена 96-луночная пластина.
Затем запечатайте пластину оптическим уплотнением ПЦР-пластины и инкубируйте пластину ПЦР, содержащую ножки при комнатной температуре, в течение двух-пяти минут с последующей инкубацией при 98 градусах Цельсия в течение двух минут. Дайте пластине остыть до комнатной температуры. Для ПЦР подготовьте мастер-микс, содержащий предпочтительные компоненты, а затем используйте многоканальную пипетку для переноса 19 микролитров мастер-смеси в каждую скважину 96-луночной пластины.
После переноса одного микролитра раствора высвобождения ДНК, содержащего ранее подготовленную ДНК комара, на пластину, запечатайте пластину уплотнением оптической ПЦР-пластины. Выполните ПЦР с соответствующими параметрами циклирования для создания профилей термического расплава в соответствии с параметрами, описанными в рукописи, затем изучите профили расплава, назначив контроль дикого типа эталонному кластеру. Отметьте различные кластеры соответствующими цветами на 96-луночном шаблоне.
Затем выберите людей с кривыми интереса и удалите выбранных особей из трубок обратного креста. Кровью питаются сделанные в ней самки, с последующим сбором G2As. В репрезентативном анализе показан анализ последовательности мутанта ZIP11 Aedes aegypti.
Электроферограмма от гетерозиготных мутантов Aedes aegypti ZIP11 указывала нуклеотидное положение, где произошел индель. Индель представлен сдвигом от одинарных к двойным пикам, поскольку полиморфные положения показывают оба нуклеотида одновременно. В конце прогона количество удаленных или вставленных пар оснований вычислялось путем подсчета одиночных пиков.
Комары, содержащие мутации в генах Aedes aegypti ZIP11 и myo-fem, были генотипированы и секвенированы с использованием анализа расплава с высоким разрешением HRMA. Флуоресцентные сигналы образцов были нормализованы до относительных значений от единицы к нулю. Кроме того, каждая кривая вычиталась из ссылки дикого типа и обозначала соответствующее увеличение.
Неудачное автоматическое назначение кластера отображается в репрезентативных результатах, где не было проведено надлежащего различия между группами. Далее каждый образец анализировали индивидуально и относили к правильным группам на основе сходства с эталонными образцами гетерозигот, гомозигот и трансгетерозигот. После выполнения HRMA секвенирование ДНК от мутировавших людей необходимо для анализа инделей и выявления других мутаций в целевой последовательности.
