Этот четко определенный протокол рассматривает первичную миграцию нервного гребня у млекопитающих. Мы используем первичную миграцию нервного гребня для изучения врожденных дефектов, влияющих на нервный гребень. Такой подход позволяет нам более внимательно взглянуть на нервные клетки гребня, как они выходят из нервной пластины.
Тестирование на клеточное поведение в тканях, несущих очарование мутантных генов или после фармацевтического лечения, позволяет скрининг на последствия лечения наркотиков или изменения окружающей среды во время эмбрионального развития. Аналогичный подход может быть использован для изучения нервных клеток гребня, которые мигрируют в сердце или кишечник или для изучения метастатических опухолевых клеток. Угадывать анатомию права зародыша сложно.
Его ткани очень быстро меняются во время раннего развития. Мы предлагаем практиковать микродиссекцию перед проведением большого эксперимента. Поскольку эмбрионы живы и трехмерны, скорость и точность имеют решающее значение.
В эмбриональный день 8.5, использовать стерильные инструменты и растворы для сбора матки в контейнер ледяной PBS. Вырежьте мезометрию, чтобы отделить каждый эмбрион. Рассекают матку тщательно, отделяя каждый решающий отек.
Сбор эмбриона на правильной стадии развития имеет решающее значение для снижения изменчивости и увеличения успеха в прижении экспланта к матрице, а также миграции клеток. Сдвиньте миппы между мышечным слоем и решающей тканью эмбриона и используйте вторую пару типсов для удаления мышечного слоя. Используйте типсы, чтобы пробить decidua по краям мезометриальной тянуть и использовать вторую пару типсов разорвать ткани открыты перпендикулярно тянуть.
Очистите решающую ткань с помощью типсов, чтобы визуализировать мембрану рикартов, прежде чем тщательно удалить мембрану. Висцеральный желток сак станет видимым и эмбрион будет наблюдаться внутри. Удалите висцеральный желток сак и анион, и положение эмбриона, чтобы визуализация головы раза.
Вырежьте складку головы над сердцем и соскребли лежащий в основе мезодерм, чтобы получить чистую нервную пластину. Затем границы нервной пластины должны быть вскрыты. Используя стеклянную пипетку Pasteur, перенесите вскрытую нейронную пластину на гидрогель покрытием блюдо, наполненное условным нервным гребнем среды и осторожно вихрем блюдо позиционировать нервной пластины в середине хорошо.
Затем инкубировать нейронную пластину при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа для соответствующего экспериментального периода времени. В течение 24 часов после explanting, место ткани культуры блюдо в образец держателя лица контрастного микроскопа, и ленты вниз крышкой пластины и двуокиси углерода иглы для предотвращения встряхивания во время нескольких хорошо приобретения. Затем сосредоточьтесь на черепных нервных клетках гребня при 10-м увеличении с соответствующим фазовым кольцом в выбранном конденсаторе.
Для количественной оценки миграционной способности нервных гребней, установите микроскоп, чтобы приобрести один кадр каждые пять минут в 10 раз больше. Для количественной оценки морфологии клеток установите микроскоп для получения одного кадра в минуту при увеличении в 40 раз. Для количественной оценки динамики ламеллиподии установите микроскоп для получения одного кадра каждые 10 секунд в течение 10 минут при 40-м увеличении.
Для мульти-хорошо изображения, установить механическую стадию для перемещения между выбранными X, Y позиции, представляющие интерес, и подтвердить, что черепные нервные клетки гребня находятся в фокусе, и что положение сцены являются правильными. Затем нажмите приобрести, чтобы начать промежуток времени изображения. Для отслеживания одной ячейки, открытого изображения J и импортировать данные в качестве файлов tiff стек.
Измените ориентацию и яркость и уровни контрастности и нажмите анализ и установите шкалу для калибровки точечных файлов stk в пиксельных микрометрах в соответствии с настройками микроскопа. Нажмите плагины, отслеживания и ручного отслеживания, чтобы открыть изображение J ручной плагин отслеживания ячейки и выбрать добавить трек, чтобы начать отслеживание ячейки. Затем отслеживайте ячейки через все кадры фильмов замедленного действия, используя ядро в качестве точки отсчета.
Чтобы оценить миграционную способность нейронного гребня, откройте подходящую программу анализа миграции и нажмите на вкладку данных импорта, чтобы импортировать данные отслеживания ячеек в качестве файла dot txt. При наборе данных и инициализации выберите количество срезов или кадров для анализа и установите калибровку X Y и интервал времени между кадрами. Выберите настройки применения для сохранения настроек.
Затем выберите символ данных участка для формирования участков траектории и выберите символ статистики для количественной оценки расстояния и скорости. Для количественной оценки области нейронных клеток гребня и круговорота, открытого изображения J и под анализом и набором измерений, нажмите, чтобы выбрать параметры формы клетки, область клетки, периметр и дескриптор формы. Используйте инструмент свободного выбора руки, чтобы вручную нарисовать контур вокруг каждой клетки, используя границы клеточной мембраны в качестве руководства.
Клавиши управления прессом на клавиатуре для поддержания наложения контура ячейки на изображение и повторения для каждой ячейки в течение каждого промежутка времени. Нажмите на наложение изображения и для достижения интереса менеджера и выберите ячейки, представляющие интерес. Затем нажмите меру, чтобы получить значения для выбранных параметров формы ячейки интерес.
В течение 24 часов после экспланта и культуры, область до мигрирующих эпителиальных черепных нервный гребень можно четко наблюдать окружающих нервной пластины explant. Кроме того, субпопуляция нервных клеток гребня будет претерпела эпителиальный мезенхимальный переход и появляются полностью мезенхимальные. Эксплантные культуры, помытые либо внеклеточным матричным гидрогелем, либо фибронектином, образуют аналогичные структуры эксплантов, состоящие из нервной пластины премьериграторного нервного гребня и мигрирующих популяций нервных гребней.
Однако explants потроханные на фибронектине производят клетки с более видно lamellipodia на крае клетки leading seemingly более поляризованном в направлении переселения. Микроскопия промежуток времени позволяет отслеживать X, Y координаты отдельных клеток и анализ миграции нервных гребневых клеток и анализ морфологии клеток черепа нервного гребня с течением времени. Путем конспектирования отдельных клеточных мембран, площадь клеток и измерения периметра могут быть рассчитаны из всех кадров фильмов, чтобы позволить последующую количественную оценку области клетки и круговорота отдельных и групп клеток.
Обратите внимание, что, как клетки мигрируют от explant, площадь клетки значительно увеличивается в то время как круговые клетки остается относительно постоянным, предполагая, что, как клетки отходят от эпителиального края и теряют клетки к контакту клеток, они показывают увеличение области распространения клеток. Обратите особое внимание на выскабливание лежащего в основе мезодерма, чтобы получить чистую нейронную пластину, так как это способствует миграции нервных клеток гребня от ткани. Многие другие методы, такие как иммуностеинирование, RTPCR, или анализ одноклеточных может быть выполнена для анализа различных белков или генов, представляющих интерес среди различных популяций клеток культуры.
Мы заинтересованы в развитии рулонов некоторых ключевых генов нейробластомы, которые могут быть вовлечены в миграцию нервных клеток гребня и в использовании этого подхода для изучения генов заболеваний человека.
