Этот новый протокол трансплантации костного мозга может быть использован для исследования того, как принимающие дендритные клетки регулируют трансплантат против хозяина и трансплантата против лейкемии ответы после трансплантации. Регенерация клеток Ex vivo позволяет адаптировать этот протокол для проверки роли других популяций иммунных клеток, таких как макрофаг и нейтрофилов, просто изменяя состояние культуры. Демонстрацией процедуры со мной будут руководитель лаборатории Кристал Хсак и студент Санджив Гуршани.
Для донорской Т-клеточной истощенной подготовки C57BL/6 костного мозга, урожай бедренной кости и голени в соответствии со стандартными протоколами от усыпляемых мышей-доноров и передачи костей в 92 миллиметра диаметром Петри блюдо, содержащее 1%RPMI среды. Используя ножницы, удалить концы из каждой кости и заполнить три миллилитров шприц оснащен 26 калибровочных иглы со свежим 1%RPMI среды. Вставьте иглу в один конец одной кости и угнетайте поршень, чтобы вымыть костный мозг из полости и в ситечко клетки сбора.
Когда весь костный мозг будет собран, процедите кусочки костного мозга через 75-метровый сетчатый фильтр и перенесите одноклеточную подвеску в новую 50-миллилитровую трубку. Осадок клеток центрифугации и повторно гранулы в 20 раз 10 до шести клеток на миллилитр концентрации в PBS дополняется 0,5% BSA. Затем добавьте 0,05 микрограмма антитела THI1 на один раз 10 в шесть клеток для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия.
В конце инкубации, мыть клетки дважды с 10 миллилитров ледяной PBS и повторно гранулы в два раза от 10 до семи клеток на миллилитр концентрации в 0,5%BSA дополнены 10%молодой кролик дополнение и 2%DNAse в стерильной воде для 45-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию. В конце инкубации, мыть клетки дважды с 15 миллилитров свежего PBS за стирку и повторно гранулы в 20 миллилитров PBS, содержащих 0,5%BSA. Бассейн лимфатических узлов и селезенки в 40 микрометровый поры ситечко и использовать шприц порнер для macerate тканей через фильтры, чтобы освободить клетки.
Вымойте ситечко и поршень со средой RPMI, дополненной 1%FBS, чтобы собрать все клетки и от осадки клеток центрифугой. Добавьте пять миллилитров буфера лиза ACK в клеточные гранулы. После пяти минут при комнатной температуре, остановить реакцию с пятью миллилитров среднего дополняется 1%FBS и гранулы белых кровяных телец центрифугации.
Переусердуйте гранулы в пяти миллилитров буфера MACS для подсчета и разбавления клеток до концентрации в два раза от 10 до восьми ячеек на миллилитр в свежем буфере MACS. Добавьте соответствующую концентрацию антиэритроидов, анти-гранулоцитов, анти-В-клеток и анти-НК-клеток истощения антител на один раз от 10 до шести клеток для 15-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть клетки с 10 миллилитров ледяного буфера MACS и повторно гранулы в один раз от 10 до восьми клеток на миллилитр концентрации в свежем буфере MACS.
Далее добавьте 0,22 микролитера антибиотиновых микробусов на 10 раз в шесть клеток с смешиванием для 15-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть клетки с 10 миллилитров ледяного буфера MACS и собирать неограниченные обогащенные Т-клетки магнитного разделения шарика с помощью MACSxpress сепаратор в соответствии со стандартными протоколами изоляции бисера. В конце отделения осадочные Т-клетки путем центрифугации и повторного вложения гранул в пять миллилитров свежего буфера MACS для подсчета.
Для генерации костного мозга полученных дендритных клеток, изолировать костный мозг от бедренной кости дикого типа или фактор B нокаут мышей, как попродемонстрировано, и лизировать красные кровяные тельца в пяти миллилитров ACK лиза буфера, останавливая реакцию с 10 миллилитров RPMI дополнены 1%FBS через пять минут. После сбора целых кровяных клеток центрифугации, повторно гранулы в 10 миллилитров культуры среднего до двух раз от 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации и добавить 20 нанограмм на миллилитр ГМ-CSF к клеткам до посева 10 миллилитров клеток на отдельные 100 на 15 миллиметров Петри блюда при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение шести дней. На шестой день активируйте дендритные клеточные культуры костного мозга с 25 микрограммами на миллилитр LPS на тарелку.
По крайней мере 85% культурных клеток костного мозга дифференцируются в дендритные клетки. Чистота Т-клеток после обогащения магнитного шарика составляет 90%Основная модель MHC, несоответствуя C57BL/6 BALB/c, тесно соответствует развитию GVHD после трансплантации. Пик тяжести происходит примерно через 11 дней после переноса клеток с последующим снижением клинических результатов и восстановлением массы тела до 16-го дня.
Получатели равномерно уступили GVHD от 30 до 40 дней после пересадки. Интересно, что трансплантация с фактором B нокаут дендритных клеток улучшает выживаемость реципиента и GVHD клинических баллов. Люцифераза-трансдуцированная А20 В-клеточная лимфома позволяет контролировать рост опухоли у живых животных.
В этом репрезентативном эксперименте все получатели дикого типа BALB/c, которые получали только костный мозг плюс A20, умерли от рецидива опухоли. Дикий тип BALB / C реципиентов, пересаженных с костного мозга полученных АКК1 истощенных доноров Т-клеток умер от GVHD. Кроме того, животные, получившие донорский костный мозг и Т-клетки, истощенные ACC1, умерли как от ГВХД, так и от рецидива опухоли.
Для генерации достаточного количества клеток костного мозга, собранные кости голени и бедренной кости должны быть полностью свободны от мышечной ткани до коррекции костного мозга. Отрицательная очистка клеток костного мозга с биотинилазы анти-CD3 и анти-биотин MicroBeads также может в выполняется для истощения лимфоцитов из костного мозга.
