Микрошафинг является очень мощным инструментом, поскольку он позволяет изучать клеточные реакции для определения биохимических и биофизических сигналов, с которыми клетки сталкиваются в живых организмах. В отличие от других методов, описанный является более гибким для генерации шаблонов. Например, это позволяет производство градиентов и микро-шаблонов нескольких белков с высокой воспроизводимостью.
Наша группа использует LIMAP не только для изучения нейронального патового предопределения, но и для того, как другие клетки реагируют на сигналы, влияющие на пролиферацию клеток, дифференциацию и миграцию. Микро-шаблон используется для ответа на фундаментальные вопросы в клеточной биологии. Полученные знания могут быть использованы для изменения существующих устройств в регенеративной медицине, например, ремонт нерва после повреждения периферического нерва.
Начните с разработки шаблонов для шаблонов на программном обеспечении цифрового рисования. Выберите размер изображения 1, 824 пикселей в длину и 1140 пикселей в ширину. Создайте шаблон и сохраните шаблон в качестве 8-битного файла TIFF.
Перед узором, очистить и активировать поверхность с плазменным очистителем с использованием давления процесса от 1000 до 1, 300 миллиторов и мощностью 29,6 Вт в течение одной-пяти минут. Используйте блюдо из стеклянного дна с 20-миллиметровым внутренним размером и толщиной стекла от 0,16 до 0,19 миллиметра. Выберите либо шесть хорошо или одного хорошо блюдо, в зависимости от количества условий, тестируются.
Вырезать PDMS трафареты в стерильных условиях, чтобы убедиться, что они вписываются во внутреннее стекло дно хорошо. Удалите внутренние пломбы микроуэлла стерильными типсами и хорошо наклейте трафареты на стекло. Подготовь в PBS раствор PLL-PEG по 0,1 миллиграмма на миллилитр и добавьте по 20 микролитров к каждому микровлайку.
Затем инкубировать блюдо при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации удалите из каждой колодец 15 микролитров PLL-PEG и вымойте его пять раз 20 микролитров PBS, не давая ему высохнуть. Подготовьте один микроуэлл для создания эталонного шаблона, удалив 18 микролитров PBS из одной колодец и добавив пять микролитров фотоинициатора, оставив PBS в оставшихся микроуровлях.
Затем используйте флуоресцентный маркер, чтобы хорошо отметить пустое внутреннее стекло. Распоить значительно выше цели, и настроить объективную направленность до тех пор, пока логотип PRIMO и слоган заботиться о ваших клетках "находятся в центре внимания. Затем завехай положение координационного самолета.
Чтобы создать эталонный шаблон, визуализировать край микроуэлла с помощью фотоинициатора с помощью передаваемого света через камеру, и выбрать символ ROI из правого меню. Выберите PRIMO для загрузки желаемого шаблона шаблона, который будет проецироваться на рентабельность инвестиций в качестве конструктора. Перейдите в периферийную область микроуэлла, выберите Lock и отрегулируйте фокус на положение калибровки.
Затем выберите Play, чтобы начать фотопаттернирование эталонного шаблона. Вымойте микроуэлл эталонного шаблона три раза с помощью 20 микролитров PBS, чтобы удалить фотоинициатор. Затем добавьте 20 микролитров флуоресцентно помеченной внеклеточной матрицы, или ECM, белкового раствора.
Инкубировать блюдо при комнатной температуре в течение 10 до 20 минут, убедившись, чтобы защитить ссылку хорошо от света. После инкубации удалите 18 микролитров белкового раствора и трижды промойте колодец 20 микролитров PBS. Используйте эпифлюоресценцию микроскопа для визуализации эталонного шаблона.
Отрегулируйте фокус на краях шаблона через траекторию камеры и заметь положение в соответствии с наилучшим фокусом. Это положение будет оптимальным лазерным фокусом, используемым для последующего узора. В стерильных условиях удалите 18 микролитров PBS со всех микроуровн.
Добавьте пять микролитров фотоинициатора к каждой хорошо, и гомогенизировать путем трубопроводов вверх и вниз. При шаблоне нескольких белков в одном и том же микроуэлле загрузите все наборы желаемых шаблонов одновременно. Затем выберите количество строк, столбцов и дозы.
Сохраните конфигурацию шаблона в качестве файла в программном обеспечении. Перейдите в область, где был создан эталонный шаблон, и отрегулируйте фокус на оптимальное положение. Затем выберите Play, чтобы инициировать фотопаттернирование.
Конструкционые блоки превращаются из красного в синий по мере завершения фотопаттернинга. Удалите фотоинициатор из микровелл, мыть их три раза с 20 микролитров PBS. После последней стирки удалите 18 микролитров PBS с каждого микроуэлла и добавьте 20 микролитров белкового раствора ECM.
Инкубировать блюдо при комнатной температуре от 20 до 30 минут, убедившись, чтобы защитить его от света. Затем удалите 15 микролитров белкового раствора ECM и трижды промойте микролагов с помощью 20 микролитров PBS. Чтобы предотвратить перекрестное связывание, добавьте 20 микролитров PLL-PEG, или BSA, в микроуэллы и инкубировать блюдо при комнатной температуре в течение одного часа, в темноте.
Затем удалите 15 микролитров блокирующего агента и трижды помойте все микролагов 20 микролитров PBS. Удалите 18 микролитров PBS и добавьте 5 микролитров фотоинициатора к каждому микроуэллу, гарантируя, что фотоинициатор однороден на всей поверхности микроуровн. Перейдите на первый микроуровн и загрузите сохраненную ранее конфигурацию шаблона.
Затем выберите действия, которые будут узорчаты для второго раунда фотопаттернинга, убедившись, что выберите действия из первого раунда. После фотопаттернинга удалите PLPP, стирая PBS. Затем инкубировать в течение 20 минут со вторым раствором белка ECM, и мыть микроуэллы три раза с 20 микролитров PBS.
Используйте эпифлюоресценцию микроскопа для визуализации и изображения печатных моделей. Когда готовы пластины клеток, добавить один миллилитр среды с клетками к внутреннему стеклу хорошо, убедившись, чтобы покрыть все микроуровн. И поместите блюдо культуры в 37 градусов по Цельсию, и 5%углекислого газа инкубатора.
Для обеспечения того, чтобы генерируемые узоры были точным представлением шаблона, измерения интенсивности флуоресценции получены вдоль полос и из соответствующей фоновой области над каждой полосой. Воспроизводимые определенные микро-шаблоны достигаются в диапазоне от 20 до 2 микрометров в ширину, но эффект края можно наблюдать при печати функций 20 микрометров или шире. Определенные концентрации белка получают либо инкубации с различной концентрацией белка, или изменение лазерной дозы, которая используется для расщепления антиклейной пленки.
Интенсивность лазера пропорциональна уровню серой шкалы шаблона, генерируя градиенты УФ-освещения. Измерение профиля интенсивности флуоресценции по градиентной полосе линейно в шаблоне шаблона и в генерируемом градиентном рисунке. Этот протокол может быть использован для создания микро-шаблонов с несколькими белками в одном микроуэлле, таких как поперечные узоры с горизонтальными полосами фибронектина и вертикальные полосы ламинина.
Но блокирующий шаг необходим для предотвращения перекрестного связывания белков. Генерируемые поперечные модели могут быть впоследствии использованы для клеточных анализов с нейрональными клеточными линиями, или CAD-клетки, или первичные нейроны, крысы DRGs. При выполнении этого протокола, наиболее важные аспекты, чтобы помнить делают надлежащую калибровку системы, не давая microwells высыхания во время нескольких шагов стирки, и с использованием правильных параметров для инкубации белка и блокирования.
Анализ поведения клеток обычно включает микроскопию, такую как флуоресценция, промежуток времени, AFM. Дальнейшая характеристика может включать другие биохимические методы, такие как профилирование экспрессии генов.
