A micro-padronização é uma ferramenta muito poderosa porque permite estudar respostas celulares para definir sinais bioquímicos e biofísicos que as células encontram em organismos vivos. Em contraste com outros métodos, o descrito é mais flexível para a geração de padrões. Por exemplo, permite a produção de gradientes e micro-padrões de múltiplas proteínas com alta reprodutibilidade.
Nosso grupo usa o LIMAP não apenas para estudar a finição de caminhos neuronais, mas também como outras células respondem a sinais que têm influência na proliferação celular, diferenciação e migração. A micro-padronização é usada para responder a questões fundamentais na biologia celular. O conhecimento adquirido pode ser usado para modificar dispositivos existentes na medicina regenerativa, por exemplo, reparação nervosa após lesão nervosa periférica.
Comece projetando modelos para padronização em software de desenho digital. Selecione um tamanho de imagem de 1.824 pixels de comprimento e 1.140 pixels de largura. Projete o modelo e salve o modelo como um arquivo TIFF de 8 bits.
Antes da padronização, limpe e ative a superfície com um limpador de plasma usando uma pressão de processo de 1.000 a 1.300 militor e uma potência de 29,6 watts por um a cinco minutos. Use uma antena de fundo de vidro com um tamanho de poço interno de 20 milímetros e espessura de vidro de 0,16 a 0,19 milímetros. Selecione um prato de seis poços ou um único poço, dependendo do número de condições que estão sendo testadas.
Corte os estêncil PDMS em condições estéreis para garantir que eles se encaixem bem no fundo interno do vidro. Remova as obturações internas de microwell com fórceps estéreis e coloque bem os estêncil no vidro. Prepare uma solução PLL-PEG de 0,1 miligramas por mililitro em PBS e adicione 20 microliters a cada microwell.
Em seguida, incubar o prato em temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, remova 15 microliters do PLL-PEG de cada poço, e lave-o cinco vezes com 20 microliters de PBS sem deixá-lo secar. Prepare um microwell para criar um padrão de referência removendo 18 microliters de PBS de um único poço e adicionando cinco microliters de fotoinitiador, deixando PBS nos micro-poços restantes.
Em seguida, use um marcador fluorescente para marcar um poço de vidro interno vazio. Posicione o bem acima do objetivo e ajuste o foco objetivo até que o logotipo primo e o slogan cuidem de suas células" estejam em foco. Em seguida, registo a posição Z do plano focal.
Para criar um padrão de referência, visualize a borda do microwell com o fotoinitidor usando a luz transmitida através da câmera, e escolha o símbolo roi do menu direito. Selecione PRIMO para carregar o modelo de padrão desejado, que será projetado no ROI como uma unidade de design. Navegue até uma região periférica do microwell, selecione Bloquear e ajuste o foco na posição Z de calibração.
Em seguida, selecione Jogar para iniciar a fotopatterning do padrão de referência. Lave o micro-poço padrão de referência três vezes com 20 microliters de PBS para remover o fotoinicializador. Em seguida, adicione 20 microliters de matriz extracelular fluorescente, ou ECM, solução proteica.
Incubar o prato em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos, certificando-se de proteger bem a referência da luz. Após a incubação, remova 18 microliters de solução proteica e lave o poço três vezes com 20 microliters de PBS. Use um microscópio de epifluorescência para visualizar o padrão de referência.
Ajuste o foco nas bordas padrão através do caminho da câmera e registo a posição Z de acordo com o melhor foco. Esta posição será o foco laser ideal usado para a padronização subsequente. Em condições estéreis, remova 18 microliters de PBS de todos os microwells.
Adicione cinco microliters do fotoinicializador a cada poço, e homogeneize por pipetar para cima e para baixo. Se padronizar várias proteínas na mesma microwell, carregue todos os conjuntos de modelos de padrões desejados simultaneamente. Em seguida, selecione o número de linhas, colunas e dose.
Salve a configuração do modelo como arquivo no software. Navegue até a área onde o padrão de referência foi produzido e ajuste o foco para a posição Z ideal. Em seguida, selecione Jogar para iniciar o fotopatterning.
As unidades de design ficam de vermelho para azul à medida que o fotopatterning é concluído. Remova o fotoinitiador dos microwells lavando-os três vezes com 20 microliters de PBS. Após a última lavagem, remova 18 microliters de PBS de cada microwell, e adicione 20 microliters de solução proteica ECM.
Incubar o prato em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos, certificando-se de protegê-lo da luz. Em seguida, remova 15 microliters da solução de proteína ECM e lave os micro-poços três vezes usando 20 microliters de PBS. Para evitar a ligação cruzada, adicione 20 microliters de PLL-PEG, ou BSA, aos microwells, e incubar o prato em temperatura ambiente por uma hora, no escuro.
Em seguida, remova 15 microliters do agente de bloqueio, e lave todos os micro-poços três vezes com 20 microliters de PBS. Remova 18 microlitadores de PBS e adicione 5 microlitadores do fotoinicializador a cada microaícula, garantindo que o fotoinitidor seja homogêneo em toda a superfície dos microwells. Navegue até o primeiro microwell e carregue a configuração do modelo salva anteriormente.
Em seguida, selecione as ações a serem padronizadas para a segunda rodada de fotopatterning, certificando-se de desmarcar ações a partir da primeira rodada. Após a fotopatterar, remova o PLPP lavando com PBS. Em seguida, incubar por 20 minutos com a segunda solução de proteína ECM, e lavar os microwells três vezes com 20 microliters de PBS.
Use um microscópio de epifluorescência para visualizar e visualizar os padrões impressos. Quando estiver pronto para emplacar as células, adicione um mililitro de meio com células ao vidro interno bem, certificando-se de cobrir todas as micro-poços. E coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 graus celsius, e 5% de dióxido de carbono.
Para garantir que os padrões gerados sejam uma representação precisa do modelo, as medidas de intensidade de fluorescência são obtidas ao longo das listras e de uma região de fundo correspondente acima de cada listra. Micro-padrões definidos reprodutíveis são alcançados variando de 20 a 2 micrômetros de largura, mas um efeito de borda pode ser observado quando a impressão possui 20 micrômetros ou mais largos. Concentrações proteicas definidas são obtidas incubando com concentrações variadas de proteína, ou variando a dose de laser que é usada para cortar o filme antiadesivo.
A intensidade do laser é proporcional ao nível de escala de cinza do modelo, gerando gradientes de iluminação UV. A medição do perfil de intensidade de fluorescência ao longo da faixa gradiente, é linear no modelo de padrão, e no padrão de gradiente gerado. Este protocolo pode ser usado para criar micro-padrões com múltiplas proteínas na mesma microwell, como padrões cruzados com listras horizontais de fibronectina, e listras verticais de laminina.
Mas um passo de bloqueio é necessário para evitar a ligação cruzada de proteínas. Os padrões cruzados gerados podem ser posteriormente usados para ensaios celulares com linhas de células neuronais, ou células CAD, ou neurônios primários, DRGs de ratos. Ao executar este protocolo, os aspectos mais importantes a serem lembrados são fazer uma calibração adequada do sistema, não deixar os microwells secarem durante as múltiplas etapas de lavagem e usar os parâmetros certos para incubação e bloqueio de proteínas.
A análise do comportamento celular normalmente envolve microscopia, como fluorescência, lapso de tempo, AFM. Outra caracterização pode incluir outros métodos bioquímicos, como o perfil da expressão genética.
