イオン移動性質量分析(IM-MS)は、ペプチドのpH依存性レドックスおよびメチル結合反応から様々な生成物イオンを同定する。三次構造の分子モデリングにより、金属相関を決定することができます。IM-MSは、質量電荷と到着時間を同時に測定し、そのストイチオメトリー、プロトネーション状態、および立体構造に関連して、各製品イオンを解決し、その分子組成を同定することができます。
金属キレートペプチドのクラスを開発することは、メンケスやウィルソン病、癌、アルツハイマー病などの金属イオンのミスバランスに関連する疾患の治療につながる。まず、ESI入口チューブと針キャピラリーを約500マイクロリットルの0.1モル氷酢酸、0.1モル水酸化アンモニウム、そして最後に脱イオン水で十分に洗浄します。テキストプロトコルに記載されているネイティブ ESI-IM-MS 条件を使用して、10 ppm ポリ DL-アラニン溶液の陰イオンおよび正イオン IM-MS スペクトルをそれぞれ 10 分間収集します。
ピペット200.0マイクロリットルの0.125ミリモル代替メサノブラクチン、またはアンブ溶液を1.7ミリリットルバイアルにする。500マイクロリットルの脱イオン水で希釈し、溶液を十分に混ぜます。サンプルのpHを3.0に調整し、50マイクロリットルの1.0モル酢酸溶液を添加します。
pH調整サンプルに0.125ミリモル金属イオンの200.0マイクロリットルを加えます。次に、脱イオン水を加え、サンプルの最終体積を1.00ミリリットルにします。十分に混ぜ合わせ、室温で10分間平衡させます。
鈍い鼻の注射器を使用して、サンプルの500マイクロリットルを取り、それぞれ5分間の陰性および正のイオンESI-IM-MSスペクトルを収集する。サンプルの残りの500マイクロリットルを使用して、校正されたマイクロpH電極を使用して最終pHを記録します。これらの手順を繰り返しますが、pHをpH 4、5、6、7、8、9、または10に調整する以外に、新しい量の酢酸または水酸化アンモニウム溶液を添加します。
結果として得られる溶液の陰性イオンおよび正イオンESI-IM-MSスペクトルをそれぞれ10分間収集します。IM-MSスペクトルから、代替メサノブラクチンの荷電種が理論的な質量電荷同位体パターンに一致させることによって存在する荷電種を特定する。これを行うには、MassLynxを開き、クロマトグラムをクリックしてクロマトグラムウィンドウを開きます。
[ファイル] メニューの [開く] をクリックして、IM-MS データ ファイルを見つけて開きます。右クリックしてクロマトグラムをドラッグし、解放して IM-MS スペクトルを抽出します。スペクトラムウィンドウが開き、IM-MSスペクトルが表示されます。
スペクトル ウィンドウで、[ツール]および[同位体モデル]をクリックします。同位体のモデリングウィンドウで、amb種の分子式を入力し、荷電イオンボックスを表示するチェックボックスをオンにして、電荷状態を入力します。[OK] をクリックします。このプロセスを繰り返して、IM-MSスペクトル内のすべての種を同定し、質量電荷同位体範囲を記録します。
各アンブ種について、偶然の質量電荷種を分離し、質量電荷同位体パターンを使用して到着時間分布(ATD)を抽出します。DriftScope を開き、[ファイル] と [開く] をクリックして、IM-MS データ ファイルを見つけて開きます。マウスを使用し、左クリックして、アンブ種の質量電荷同位体パターンを拡大します。
選択ツールとマウスの左ボタンを使用して、同位体パターンを選択します。[現在の選択を受け入れる] ボタンをクリックします。偶然の質量電荷種を分離するには、選択ツールとマウス左ボタンを使用して、アンブ種の同位体パターンに合わせて ATD 時間を選択します。
[現在の選択を受け入れる] ボタンをクリックします。ATD をエクスポートするには、[ファイル]、[MassLynx へのエクスポート] に移動します。次に、[ドリフト時間を保持]を選択し、ファイルを適切なフォルダに保存します。
MassLynxのクロマトグラムウィンドウで、保存されたエクスポートされたファイルを開きます。[プロセス]をクリックし、メニューから統合し、[ApexTrack ピーク統合]ボックスをオンにして、[OK]をクリックします。ATDの中心と統合領域を記録します。保存されたすべてのアンブおよびポリDL-アラニンIM-MSデータファイルに対してこのプロセスを繰り返した後、各滴定点で抽出されたアンブ種すべてについて統合ATDを使用して、相対的なパーセンテージスケールに正規化します。
これを行うには、アンブ種のアイデンティティと各pHでの統合ATDをスプレッドシートに入力します。各 pH に対して、統合された ATD の合計を使用して、個々の Amb 種の ATD をパーセンテージスケールに正規化します。各アンブ種対pHのパーセント強度をプロットして、各種の集団がpHの関数としてどのように変化するかを示す。
スプレッドシートを使用して、ヘリウム緩衝ガスで測定されたポリDL-アラニン負イオンと正イオンの衝突断面を補正された衝突断面に変換します。次に、ポリDL-アラニンキャリブラントとアンブ種の平均到着時間をドリフトタイムに変換します。ポリDL-アラニンキャリブラントのドリフト時間と修正された衝突断面を差し込みます。
次に、最小二乗回帰適合を使用して、A素数とB値を決定し、ここでA素数は温度、圧力、および電界パラメータの補正であり、BはIMデバイスの非線形効果を補正します。これらの A 素数と B の値を中心のドリフト時間値を使用して、修正された衝突の断面と衝突の断面を決定します。この方法は、ガウスビューを使用して約2%の推定絶対誤差を有するペプチド種の衝突断面を提供し、B3LYP LanL2DZレベルの理論は、観察された質量電荷amb種のすべての可能なタイプの調整のための幾何学的最適化された適合体を見つける。
B3LYP LanL2DZレベルの理論は、ベッケの3つの境界ハイブリッド機能、ダニング基準セット、電子コア電位で構成されています。ガウス出力ファイルから最適化された適合者の熱化学分析を抽出し、シグマプログラムのイオンスケールのレナード・ジョーンズ法を用いて、その理論的衝突断面を計算します。最も低い自由エネルギーの適合者から、IM-MS測定された衝突断面に同意するLennard-Jones衝突断面を示すコンフォーマを決定する。
このプロセスは、実験で観察された適合者の三次構造と協調の種類を特定する。分子モデリングでは、異なる金属キレート部位、シスおよびトランスペプチド結合、塩橋、水素結合、およびpi-cation相互作用を有する適合者の自由エネルギーおよび衝突断面を比較する必要があります。代替メタナロバクチンのIM-MS研究は、それがpH依存的な方法で銅イオンと亜鉛イオンの両方をキレートすることを示したが、異なる反応機構および協調部位を通じて。
亜鉛(II)結合は6より大きいpHで観察され、主に単一の負電荷複合体を形成し、亜鉛(II)が2つのイミダゾールと2つのチオラ化によって四面的に調整されたことを示す。銅(II)結合はジスルフィド橋を形成するチオールを伴った。6を超えるpHで、単一の負帯電銅(II)複合体が形成され、イミダゾールと2つの脱プロトン化されたアミド窒素が銅(II)を配位していたことを示す(II)しかし、pH6以下では銅(II)を加えて、単一正に帯電した銅(I)複合体とpH6以上の単一の正電荷銅(II)錯体を形成した。
また、A00m2とamb 4のIM-MS研究では、銅反応によって、分子間または分子内ジスルフィド橋の数、銅(I)または銅(II)イオンの数、およびpHの関数として変化した脱プロトン化部位の数が異なる製品が与え出されたことも示されています。分子モデル化によるIM-MSの結果から、代わりのメサロバクチンは、チオレート、イミダゾール、カルボキシレート基を介して最大3個の銅(I)イオンを調整できることが示されました。IM-MSインストゥルメンタルの設定は、テキストに記載されているように、ペプチドのストイチオメトリー、電荷分布、および立体構造構造を保存するために慎重に選択する必要があります。
アスパラギン酸のチロシンのような金属の配位に影響を与えるより広いサイズの組合せは構造および機能間の関係のより大きい理解を可能にする。分子モデリングを用いたIM-MSは、タンパク質、DNA、脂質、およびそれらの複合体の立体構造構造を決定するための結晶学とNMR分光法を加速する代替技術となっています。
