Espectrometria de massa de ion mobilidade, ou IM-MS, identificar os diversos íons produtos a partir da reação de ligação de pH e ligação de metila de peptídeos. Com a modelagem molecular de sua estrutura terciária, a correlação metálica pode ser determinada. O IM-MS pode resolver cada um dos íons do produto e identificar sua composição molecular medindo simultaneamente seus tempos de massa para carga e chegada e relacionado com sua estequiometria, estado de protonação e estrutura conformacional.
O desenvolvimento de classes de peptídeos de quesequente metálico ajudará a levar à terapêutica para doenças associadas ao desequilíbrio de íons metálicos, como menkes e doença de Wilson, cânceres e doença de Alzheimer. Para começar, limpe a tubulação de entrada ESI e a agulha capilar completamente com cerca de 500 microliters de ácido acético glacial molar 0,1, hidróxido de amônio molar e, finalmente, água desionizada. Use condições nativas de ESI-IM-MS conforme descrito no protocolo de texto para coletar os espectros negativos e positivos do íon IM-MS da solução poli-DL-alanina de 10 ppm por 10 minutos cada.
Tubtte 200.0 microliters do 0,125 mililitros de metanoblaactina alternativa, ou solução amb, em um frasco de 1,7 mililitro. Diluir com 500 microliters de água deionizada e misturar a solução completamente. Ajuste o pH da amostra para 3.0 adicionando 50 microliters de solução de ácido acético molar 1.0.
Adicione 200,0 microliters do íon metálico de 0,125 mililitro à amostra ajustada por pH. Em seguida, adicione água deionizada para produzir um volume final de 1,00 mililitro da amostra. Misture bem e deixe a amostra equilibrar por 10 minutos à temperatura ambiente.
Usando uma seringa de nariz contundente, pegue 500 microliters da amostra e colete o espectro de íons negativos e positivos ESI-IM-MS por cinco minutos cada. Use os 500 microliters restantes da amostra para registrar seu pH final usando um eletrodo micro pH calibrado. Repita estas etapas, exceto para ajustar o pH ao pH quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou 10, adicionando novos volumes de soluções de ácido acético ou hidróxido de amônio.
Colete o espectro eSI-IM-MS negativo e positivo das soluções resultantes por 10 minutos cada. A partir do espectro IM-MS, identifique quais espécies carregadas da metanoblastona alternativa estão presentes, combinando-as com seus padrões teóricos de isótopos de massa para carga. Para isso, abra MassLynx e clique em Cromoatograma para abrir a janela chromatogram.
Vá para o menu Arquivo e Abra para localizar e abrir o arquivo de dados IM-MS. Extrair o espectro IM-MS clicando com o botão direito do mouse, arrastando-se através do cromatógrafo e liberando. A janela de espectro se abrirá, mostrando o espectro IM-MS.
Na janela de espectro, clique em Ferramentas e Modelo de Isótopos. Na janela de modelagem isótopo, digite a fórmula molecular da espécie amb, verifique a caixa de íons carregada show e entre no estado de carga. Clique em OK. Repita este processo para identificar todas as espécies do espectro IM-MS e registrar sua faixa de isótopos de carga em massa.
Para cada espécie amb, separe qualquer espécie coincidente de massa para carregar e extraia suas distribuições de tempo de chegada, ou ATDs, usando seus padrões de isótopos de massa para carga para identificá-los. Abra o DriftScope e clique em Arquivo e Aberto para localizar e abrir o arquivo de dados IM-MS. Use o mouse e o clique esquerdo para ampliar o padrão de isótopos de massa para carga da espécie amb.
Use a Ferramenta de Seleção e o botão do mouse esquerdo para selecionar o padrão isótopo. Clique no botão Aceitar seleção atual. Para separar qualquer espécie de massa por carga coincidente, use a Ferramenta de Seleção e o botão do mouse esquerdo para selecionar o tempo ATD alinhado com o padrão de isótopos da espécie amb.
Clique no botão Aceitar seleção atual. Para exportar o ATD, vá para File, Export para MassLynx. Em seguida, selecione Reter tempo de deriva e salvar o arquivo na pasta apropriada.
Na janela cromatograma de MassLynx, abra o arquivo exportado salvo. Clique em Process, Integre-se no menu, verifique a caixa de integração do Pico do Pico do ApexTrack e clique em OK. Regisso do centroide e da área integrada do ATD. Depois de repetir este processo para todos os arquivos de dados Amb e Poly-DL-alanine IM-MS, use o ATD integrado para todas as espécies de amb extraídas dos íons positivos ou negativos em cada ponto de titulação para normalizar para uma escala percentual relativa.
Para isso, insira as identidades da espécie amb e seu ATD integrado em cada pH em uma planilha. Para cada pH, use a soma dos ATDs integrados para normalizar o ATD individual da espécie amb em uma escala percentual. Traçar a porcentagem de intensidades de cada espécie de amb versus pH para mostrar como a população de cada espécie varia em função do pH.
Utilizando uma planilha, converta as seções transversais de colisão de íons poli-DL-alanina negativos e positivos medidos em gás tampão de hélio para as seções transversais de colisão corrigidas. Em seguida, converta os tempos médios de chegada dos calibrantes poli-DL-alanina e espécies de amb em tempos de deriva. Conecte os tempos de deriva dos calibradores de poli-DL-alanina versus as seções transversais de colisão corrigidas.
Em seguida, usando um ajuste de regressão de menos quadrados, determine os valores A prime e B, onde A prime é a correção para os parâmetros de temperatura, pressão e campo elétrico, e B compensa o efeito não linear do dispositivo IM. Usando estes valores A prime e B com o valor dos tempos de deriva centroid, determine suas seções transversais de colisão corrigidas e suas seções transversais de colisão. Este método fornece seções transversais de colisão para as espécies de peptídeos com erros absolutos estimados de cerca de 2% Usando gaussiano com GaussView, e o nível de teoria B3LYP LanL2DZ, localizar conformadores otimizados para geometria para todos os tipos possíveis de coordenações da espécie amb de massa observada.
O nível de teoria B3LYP LanL2DZ é composto pelos três modelos híbridos de perímetro de Becke, o conjunto de bases Dunning e os potenciais do núcleo eletrônico. Extrair as análises termoquímicas de cada um dos conformadores otimizados do arquivo de saída gaussiano e calcular suas seções transversais de colisão teórica usando o método Lennard-Jones em escala de íons do programa Sigma. A partir dos conformadores de energia livre mais baixos, determine qual conformer exibe a seção transversal de colisão Lennard-Jones que concorda com a seção transversal de colisão medida IM-MS.
Esse processo identifica a estrutura terciária e o tipo de coordenação dos conformadores observados no experimento. A modelagem molecular requer comparação das seções transversais de energia livre e colisão de conformadores com diferentes sítios de quesquente de metal, ligações cis e peptídeos trans, pontes de sal, ligação de hidrogênio e interações pi-cation. O estudo do IM-MS da metanobioactina alternativa mostrou que ele quesou íons de cobre e zinco de forma dependente do pH, mas através de diferentes mecanismos de reação e locais de coordenação.
A ligação de zinco(II) foi observada em um pH maior que seis, formando principalmente um único complexo carregado negativamente, indicando que o zinco(II) foi coordenado tetraedralmente pelos dois imidazoles e dois tioolados. A ligação de cobre(II) foi acompanhada pelos tiols formando uma ponte de dissulfeto. Em um pH maior que seis, o complexo de cobre único carregado negativamente (II) foi formado, indicando que imidazol e dois nitrogênios de amido desprotosados estavam coordenando cobre(II)No entanto, abaixo do pH seis, a adição de cobre(II) também formou o único complexo de cobre carregado positivamente (I), bem como o único complexo de cobre carregado positivamente (II) acima do pH seis.
Estudos do IM-MS de amb dois e amb quatro também mostram que as reações de cobre deram produtos que diferem nos números de pontes de dissulfeto inter ou intramolecular, número de íons de cobre (I)ou cobre(II)e número de locais de desprotonação, que mudaram em função do pH. O resultado do IM-MS com modelagem molecular mostrou que as metanobios alternativas poderiam coordenar até três íons de cobre(I)ions através dos grupos de tioolato, imidazol e carboxilato. As configurações instrumentais do IM-MS devem ser cuidadosamente escolhidas para conservar a estequiometria dos peptídeos, distribuições de carga e estruturas conformais, conforme descrito no texto.
A combinação de uma gama mais ampla de tamanho que influenciará a coordenação metálica, como a tirasina no ácido aspartic permitirá uma maior compreensão da relação entre estrutura e função. IM-MS com modelagem molecular tornaram-se técnicas alternativas para acelerar a cristalografia e a espectroscopia de RMN para determinar as estruturas conformais de proteínas, DNA, lipídios e seus complexos.
