La espectrometría de masas de movilidad de iones, o IM-MS, identifica los diversos iones de los productos que surgen de la reacción de unión a redox y metilo dependiente del pH de los péptidos. Con el modelado molecular de su estructura terciaria, se puede determinar la correlación metálica. IM-MS puede resolver cada uno de los iones del producto e identificar su composición molecular midiendo simultáneamente sus tiempos de carga y masa y llegada y relacionados con su estequiometría, estado de protonación y estructura conformacional.
El desarrollo de clases de péptidos quelantes metálicos ayudará a llevar a terapias para enfermedades asociadas con el desequilibrio de iones metálicos, como la enfermedad de Menkes y Wilson, cánceres y la enfermedad de Alzheimer. Para empezar, limpie a fondo el tubo de entrada ESI y el capilar de la aguja con unos 500 microlitros de ácido acético glacial molar, 0,1 molar hidróxido de amonio y, por último, agua desionizada. Utilice condiciones nativas de ESI-IM-MS como se describe en el protocolo de texto para recopilar los espectros IM-MS de iones negativos y positivos de la solución de poli-DL-alanina de 10 ppm durante 10 minutos cada uno.
Pipetear 200,0 microlitros de la metanbactina alternativa de 0,125 mililitros, o solución de amb, en un vial de 1,7 mililitros. Diluir con 500 microlitros de agua desionizada y mezclar la solución a fondo. Ajuste el pH de la muestra a 3.0 añadiendo 50 microlitros de solución de ácido acético 1.0 molar.
Agregue 200,0 microlitros del ion metálico 0,125 milimolar a la muestra ajustada al pH. A continuación, agregue agua desionizada para producir un volumen final de 1,00 mililitros de la muestra. Mezcle bien y deje que la muestra se equilibre durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Con una jeringa de nariz contundente, tome 500 microlitros de la muestra y recoja los espectros ESI-IM-MS de iones negativos y positivos durante cinco minutos cada uno. Utilice los 500 microlitros restantes de la muestra para registrar su pH final utilizando un electrodo de micro pH calibrado. Repita estos pasos, excepto para ajustar el pH a pH cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o 10, añadiendo nuevos volúmenes de soluciones de ácido acético o hidróxido de amonio.
Recoja los espectros ESI-IM-MS de iónica negativa y positiva de las soluciones resultantes durante 10 minutos cada una. A partir de los espectros IM-MS, identifique qué especies cargadas de la metanbactina alternativa están presentes al emparejarlas con sus patrones teóricos de isótopos de masa a carga. Para ello, abra MassLynx y haga clic en Cromatograma para abrir la ventana Cromatograma.
Vaya al menú Archivo y Abra para localizar y abrir el archivo de datos IM-MS. Extraiga el espectro IM-MS haciendo clic con el botón derecho, arrastrando a través del cromatograma y soltándolo. Se abrirá la ventana de espectro, que muestra el espectro IM-MS.
En la ventana de espectro, haga clic en Herramientas y modelo de isótopo. En la ventana Modelado de isótopos, ingrese la fórmula molecular de la especie amb, marque la casilla Mostrar iones cargados e introduzca el estado de carga. Haga clic en Aceptar. Repita este proceso para identificar todas las especies en el espectro IM-MS, y registrar su rango de isótopos de masa a carga.
Para cada especie de amb, separe cualquier especie coincidente de masa a carga y extraiga sus distribuciones de tiempo de llegada, o ATD, utilizando sus patrones de isótopos de masa a carga para identificarlos. Abra DriftScope y haga clic en Archivo y Abrir para localizar y abrir el archivo de datos IM-MS. Utilice el ratón y haga clic con el botón izquierdo para acercar el patrón de isótopo de masa a carga de la especie amb.
Utilice la Herramienta Selección y el botón izquierdo del ratón para seleccionar el patrón de isótopos. Haga clic en el botón Aceptar selección actual. Para separar cualquier especie coincidente de masa a carga, utilice la Herramienta Selección y el botón izquierdo del ratón para seleccionar el tiempo ATD alineado con el patrón de isótopos de la especie amb.
Haga clic en el botón Aceptar selección actual. Para exportar el ATD, vaya a Archivo, Exportar a MassLynx. A continuación, seleccione Conservar tiempo de deriva y guarde el archivo en la carpeta adecuada.
En la ventana Cromatograma de MassLynx, abra el archivo exportado guardado. Haga clic en Procesar, Integrar en el menú, marque la casilla Integración de ApexTrack Peak y haga clic en Aceptar. Registre el centroide y el área integrada del ATD. Después de repetir este proceso para todos los archivos de datos IM-MS de amb y poli-DL-alanina guardados, utilice el ATD integrado para todas las especies de amb extraídas de los iones positivos o negativos en cada punto de valoración para normalizar a una escala porcentual relativa.
Para ello, introduzca las identidades de la especie amb y su ATD integrado en cada pH en una hoja de cálculo. Para cada pH, utilice la suma de los ATD integrados para normalizar el ATD de la especie amb individual a una escala porcentual. Trazar las intensidades porcentuales de cada especie de amb frente al pH para mostrar cómo la población de cada especie varía en función del pH.
Usando una hoja de cálculo, convierta las secciones transversales de colisión de iones negativos y positivos de poli-DL-alanina medidos en gas amortiguador de helio en las secciones transversales de colisión corregidas. A continuación, convierta los tiempos medios de llegada de los calibradores de poli-DL-alanina y las especies de amb en tiempos de deriva. Enchufe los tiempos de deriva de los calibradores de poli-DL-alanina en comparación con sus secciones transversales de colisión corregidas.
A continuación, utilizando un ajuste de regresión de mínimos cuadrados, determine los valores A primo y B, donde A primo es la corrección de los parámetros de temperatura, presión y campo eléctrico, y B compensa el efecto no lineal del dispositivo IM. Usando estos valores A primo y B con el valor de tiempos de deriva centroide, determine sus secciones transversales de colisión corregidas y sus secciones transversales de colisión. Este método proporciona secciones transversales de colisión para las especies de péptidos con errores absolutos estimados de aproximadamente el 2% utilizando gaussiano con GaussView, y el nivel de teoría B3LYP LanL2DZ, localizan conformadores optimizados para geometría para todos los tipos posibles de coordinación de la especie de amb de masa a carga observada.
El nivel de teoría B3LYP LanL2DZ se compone de las tres funciones híbridas perimetrales Becke, el conjunto de bases de Dunning y los potenciales de núcleo de electrones. Extraiga los análisis termoquímicos de cada uno de los conformadores optimizados del archivo de salida gaussiano y calcule sus secciones transversales teóricas de colisión utilizando el método Lennard-Jones escalado por iónica del programa Sigma. A partir de los conformadores de energía libre más bajos, determine qué conformador exhibe la sección transversal de colisión Lennard-Jones que está de acuerdo con la sección transversal de colisión medida IM-MS.
Este proceso identifica la estructura terciaria y el tipo de coordinación para los conformadores observados en el experimento. El modelado molecular requiere la comparación de las secciones transversales de energía libre y colisión de los conformadores con diferentes sitios quelantes de metales, enlaces cis y péptidos trans, puentes de sal, unión de hidrógeno e interacciones pi-cación. El estudio IM-MS de la metanbactina alternativa mostró que quelababa tanto los iones de cobre como los zinces de una manera dependiente del pH, pero a través de diferentes mecanismos de reacción y sitios de coordinación.
La unión al zinc (II) se observó a un pH superior a seis, formando principalmente un único complejo cargado negativamente, lo que indica que el zinc(II) estaba coordinado tetrahedrally por los dos imidazoles y dos tiolados. La unión de cobre (II) iba acompañada de los tiols que formaron un puente de disulfuro. Con un pH superior a seis, se formó el único complejo de cobre(II)cargado negativamente, lo que indica que el imidazol y dos nitrógenos de amida desprotonados coordinaban el cobre(II)Sin embargo, por debajo del pH seis, añadiendo cobre(II)también formaba el único complejo de cobre(I)de carga positiva, así como el único complejo de cobre (II) cargado positivamente por encima del pH seis.
Los estudios IM-MS de amb dos y amb four también muestran que las reacciones de cobre dieron productos que diferían en el número de puentes de disulfuro intermoleculares o intermoleculares, número de iones de cobre(I) o cobre(II), y número de sitios de desprotonación, que cambiaron en función del pH. El resultado de IM-MS con el modelado molecular mostró que las metanbactinas alternativas podían coordinar hasta tres iones de cobre (I)ions a través de los grupos de tiolados, imidazoles y carboxilato. Los ajustes instrumentales de IM-MS deben elegirse cuidadosamente para conservar la estequiometría de los péptidos, las distribuciones de carga y las estructuras conformacionales, como se describe en el texto.
La combinación de una gama más amplia de tamaño que influirá en la coordinación del metal, como la tirosina en el ácido aspártico, permitirá una mayor comprensión de la relación entre la estructura y la función. IM-MS con modelado molecular se han convertido en técnicas alternativas para acelerar la cristalografía y la espectroscopia de RMN para determinar las estructuras conformacionales de proteínas, ADN, lípidos y sus complejos.
