Общая цель этого исследования заключается в получении Time-Lapse 2D-изображения фагоцитической активности в M1 Макрофаги 4T1 Мыши Молочные карциномы клеток в совместной культуры. Модель со-культур жизненных клеток была создана и соблюдена с использованием комбинации флуоресцентной и дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии. Оценка активности фагоцитоза макрофагами была изображением; с помощью программного обеспечения для визуализации, чтобы удвоить многотясное замедленное видео, до наглядного нашего инкубации.
Дело в том, что мы провели около для удовлетворения потребностей и преимуществ оттачивания в поведении макрофагов и его фагоцитной активности с раковыми клетками. В частности, в исследовании мышей молочной железы карциномы. Первая часть этого исследования начинается с живых клеток совместной культуры модели 4T1 мыши молочных карцином клеток и RAW 2647 мыши макрофаги.
Начните эксперимент с культивирования 41 мыши молочных карцином клеток и RAW 2647 мыши макрофагов. Во-первых, оттаивать флакон 4T1 и RAW 2647 клеток. Разбавить размороженные клетки в 10 миллиметров в 15 мельниц конической трубки.
Далее центрифуга клетки при 660 г заставляют в течение 5 минут получать клеточные гранулы. Тщательно аспирировать средства массовой информации, повторно приостановить клетки в 8 мельницы полного средства массовой информации и передачи клеток в флябе культуры тканей. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5 процентов углекислого газа.
После одной недели культивирования в условиях адепта, контролировать колбу ежедневно и дополнить atmil полный сми по мере необходимости. Следующим шагом продолжится иммуностай М1 поляризованных макрофагов RAW 2647. Этот шаг заключается в обеспечении полной поляризации макрофагов М1.
Как слияние RAW 2647 достигла 70 до 80 процентов отказаться от культуры средств массовой информации и осторожно промыть дважды с PBS. Подготовь макрофаги для сбора, аккуратно выбить клетки-адепты с помощью клеточного скреппера и перенести в 50-тысячную коническую трубку. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовьте ячейку, подвесную при плотности 100 000 клеток на тарелку, добавив оставшийся раствор в плотность сидения.
Сядьте 2 мельницы макрофагов подвески в два изображения блюд. Инкубировать клетки от 2 до 3 часов при 37 градусах по Цельсию с 5 процентов углекислого газа, чтобы клетки присоединения. Подготовь средства массовой информации поляризации M1, добавив 100 ниллиграмм на мельницу LPS и 20 ниллиграмм на мельницу интерферон-гамма в полную среду, дополненную 10 процентами FBS.
Отбросьте культуры супернатант из макрофагов, инкубированных до и тщательно мыть монослой в блюдо дважды с помощью PBS. Добавьте 2 мельницы средств поляризации M1 в одно из соответствующих блюд и позвольте клеткам дуры влиться в макрофаги M1 финнатип. Перед иммуностернированием, исправить RAW и M1 макрофаги клеток с использованием 2 мельницы 4 процентов параформальдегида и инкубировать в течение 50 минут в комнатной температуре.
Удалить супернатант и мыть клетки монослой с помощью PBS, по крайней мере три раза. Утолить 2 мельницы 50 миллиметров хлорида аммония в PBS и инкубировать в течение 50 минут в комнатной температуре. Permeabilize использованием 0,3 процента Triton X-100 в PBS в течение 50 минут при комнатной температуре.
Блокирующий шаг с использованием 10 процентов FBS в течение 30 минут при комнатной температуре PBS. Инкубировать с анти-iNOS антитела конъюгированных FITC в PBS и один процент FBS ночь при 4 градусах по Цельсию. Инкубировать 1 мельницу DAPI в визуализации посуды в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию в темном состоянии, покрыв алюминиевой фольгой.
Вымойте клетки с помощью PBS по крайней мере 3 раза и добавить 1 мельницу DMEM в соответствующие блюда и готовы к флуоресцентной визуализации. Следующим шагом приступить к посеву 4T1 мыши молочных карцином клеток. По мере того как слияние клеток 4T1 достигает 70 до 80 процентов сбросить средства культуры и gentley промыть дважды с PBS.
Добавьте 1 мельницу предварительно разогретого трипсина, чтобы де-ассоциировать клетки и инкубации до 20 минут при 37 градусах Цельсия. Как только клетки появляются де-прилагается, передачи де-прикрепленных клеток на 15 мельниц конической трубки. И добавить 2 мельницы предварительно разогретой полной среды для инактивации трубки видел.
Центрифуга при 600 г силы в течение 5 минут, чтобы получить гранулы клетки. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы в 10 мельниц предварительной выборки DMEM среды. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и семян 100 000 клеток в мельницу DMEM.
В изображении эти с ТС обработаны. Следующим шагом является маркировка живых 4T1 мыши молочных карциномных клеток с помощью CFSE окрашивания. Во-первых, удалите существующие средства массовой информации из изображения блюдо, которое ранее посеяны с 4T1 клеток.
Подготовка CFSE окрашивания решение путем разбавления CFSE окрашивания в 1 мельница PBS, чтобы сделать 5 macrmal из рабочих согласия. Добавьте 1 мельницу раствора окрашивания CFSE в окрашивание для инкубации клеток в течение 20 минут при комнатной температуре или 37 градусов по Цельсию в темноте. Добавить равный DMEM к клеткам плюс окрашивание раствор и позволяют семян в течение 5 минут.
Следующим шагом является семя RAW2647 мыши макрофаги и совместной культуры с 4T1. После того, как CFSE выравнивает клетки 4T1, мыть изображение блюдо в два раза, используя PBS. Семя 2 мельницы макрофагов суспензии в 4T1 изображение блюдо.
Следующим шагом является поляризация макрофагов RAW 4627 в финнатип M1. Добавьте 2 мельницы средств поляризации M1 в воображаемое блюдо и позвольте клеткам RAW влиться в макрофаг-финнатип M1. Вторая часть исследования является промежуток времени оценки M1 макрофагов фагоцитов 4T1 клеток.
Следующим шагом является оценка фагоцитоза видеоскопии в реальном среду. Во-первых, включите микроскоп. Установите температуру на уровне 37 градусов по Цельсию.
И 5 процентов углекислого газа. Распоить клетки со-культуры в центре сцены и аккуратно винт на верхней камере. Используйте джойстик, чтобы моторизировать сцену, выбрав другое положение, чтобы быть захвачены.
Есть много факторов, которые необходимо учитывать при выполнении живой клетки изображения. Чтобы получить довольно небольшое видео. Это требует оптимизации экспозиции изображений, измерения времени, а также автоматизации коррекции фокусировки.
В случае, если видео более подвергаются, неправильный интервал времени, а также из фокуса, будет стоить видео, чтобы быть непригодным для использования. Повторение эксперимента необходимо сделать, если один из этих факторов был обнаружен. Рисунок один показывает иммунофторесценции поворота с анти-iNOS в зеленом цвете.
Ядерный маркер DAPI синим цветом. И расширенные версии большинства изображений. Фильм 1 является репрезентативным живой ячейки фильм понимания M1 макрофагов и 4T1.
CFSE окрашенных большинство клеток молочной железы карциномы совместно культур захватили с помощью многоканальные приобретения флуоресцентных и IC микроскопии. Фильм 2 live-cell видео микроскопии фильмы из нескольких точеных в одном супружеском блюде. Отображение фагоцитоза 4T1 индуцированными макрофагами M1.
Изображения были сняты с интервалом в 50 минут в течение 13 часов. Фильм 3 live-cell видео микроскопии фильм, одной точки координат выбрали, чтобы показать углубленную визуализацию фагоцитоза 4T1 по M1 Макрофаги. Красные стрелки показывают макрофаги M1, желтый круг показывает, что ряд клеток 4T1 утоляют фтор и гоффман клеток 4T1.
M1 макрофаги двигаться-логии описать как porocytoplasm были, как 4T1 мыши памяти карциномы эпителия морфологии. Макрофаги можно увидеть движущихся добавить 4T1 клетки для установления контакта клетки к клеткам. За этим следует поглощение 4T1 клеток на макрофаги M1.
После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание о том, как выполнить эксперимент живой клетки видео микроскопии; с 4T1 мыши молочной карциномы и RAW 2647 merad макрофаги. Вы также должны быть в состоянии создать в течение ночи совместно культур обоих типов клеток для выполнения фагоцитоза эссе. Вы также должны понимать, как со-культумеры 4T1 с LPS и интерферон-гамма макрофаги.
