L'obiettivo generale di questo studio è quello di ottenere un Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic activity in M1 Macrophages 4T1 Mouse Mammary Carcinomas Cells in Co-cultures. Il modello di co-colture delle cellule di vita è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. La valutazione dell'attività della fagocitosi da parte dei macrofagi è stata l'immagine;l'utilizzo di software di imaging per raddoppiare il video di time lapse multi point, prima di testare la nostra incubazione.
La questione che abbiamo condotto per soddisfare i bisogni e i benefici della leccatura nel comportamento dei macrofagi e della sua attività fagocitica con le cellule tumorali. Nello studio è specifico il carcinoma mammario del topo. La prima parte di questo studio inizia con il modello di co-coltura delle cellule vive di cellule carcinomi mammarie di topo 4T1 e macrofagi di topo RAW 2647.
Inizia l'esperimento coltivando 41 cellule carcinomi mammarie del topo e macrofagi di topo RAW 2647. In primo luogo, scongelare una fiala di cellule 4T1 e RAW 2647. Diluire le celle scongelate in 10 millimetri in un tubo conico da 15 mill.
Quindi, centrifugare le cellule a 660 g di forza per 5 minuti per ottenere pellet cellulare. Aspirare attentamente il supporto, sospendere di nuovo le cellule in 8 mulini di mezzi completi e trasferire le cellule nel pallone di coltura tissutale. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Dopo una settimana di coltivazione in condizioni di adesione, monitorare quotidianamente il pallone e integrare con supporti completi atmil in base alle esigenze. Il passo successivo continua con l'immunosottenzione dei macrofagi RAW 2647 polarizzati M1. Questo passaggio è quello di garantire una polarizzazione completa dei macrofagi M1.
Poiché la confluenza di RAW 2647 ha raggiunto il 70-80% scartare i mezzi di coltura e risciacquare delicatamente due volte con PBS. Preparare i macrofagi per la raccolta spodesando delicatamente le cellule aderenti utilizzando un raschietto a celle e trasferirli in un tubo conico da 50 mill. Contare le cellule usando l'emocitometro e preparare una cellula sospensione ad una densità di 100.000 cellule per piatto aggiungendo la soluzione rimanente alla densità di seduta.
Sedersi 2 mulini di sospensione macrofagi in due piatti di imaging. Incubare le cellule da 2 a 3 ore a 37 gradi celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire l'aderenza cellulare. Preparare i supporti di polarizzazione M1 aggiungendo 100 nilligrammi per mill LPS e 20 nilligram per mill interferon-gamma in un mezzo completo integrato con FBS al 10%.
Scartare le colture supernatanti dai macrofagi incubati prima e lavare accuratamente i monostrati nel piatto due volte usando PBS. Aggiungere 2 mulini di mezzi di polarizzazione M1 in uno dei piatti corrispondenti e consentire alle cellule dura di infondere nel finnatipo dei macrofagi M1. Prima dell'immunosocinazione, fissare le cellule di macrofagi RAW e M1 utilizzando 2 mulini di paraformaldeide al 4% e incubare per 50 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il supernatante e lavare le cellule monostrato utilizzando PBS, almeno tre volte. Tempra con 2 mulini di cloruro di ammonio di 50 millimetri in PBS e incubare per 50 minuti a temperatura ambiente. Permeabilize utilizzando lo 0,3% di Tritone X-100 in PBS per 50 minuti a temperatura ambiente.
Passaggio di blocco utilizzando FBS al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente PBS. Incubare con anticorpo anti-iNOS coniugato FITC in PBS e l'uno per cento FBS durante la notte a 4 gradi Celsius. Incubare 1 mulino di DAPI in stoviglie di imaging per 10 minuti a 37 gradi Celsius in condizioni scure coprendo con foglio di alluminio.
Lavare le celle utilizzando PBS almeno 3 volte e aggiungere 1 mulino di DMEM in piatti abbinati e pronto per l'imaging fluorescente. Il passo successivo procede con la semina di cellule carcinomi mammarie del topo 4T1. Poiché la confluenza delle celle 4T1 raggiunge il 70-80% scarta i mezzi di coltura e risciacqua delicatamente due volte con PBS.
Aggiungere 1 mulino di tripina prerimpilato per disaciare le cellule e incubare fino a 20 minuti a 37 gradi Celsius. Una volta che le celle appaiono de-attaccate, trasferire le celle de-attaccate in un tubo conico da 15 mill. E aggiungere 2 frese di mezzo completo preri riscaldato per inattivare il tubo visto.
Centrifuga a 600 g di forza per 5 minuti per ottenere un pellet cellulare. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in un mezzo DMEM di campionamento prerun di 10 mulini. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro e seminare 100.000 cellule nel mulino DMEM.
Nell'imaging questi con TC trattato. Il prossimo passo è etichettare le cellule carcinomi mammarie del topo 4T1 viventi utilizzando la colorazione CFSE. In primo luogo, rimuovere i supporti esistenti dal piatto di imaging precedentemente seminato con celle 4T1.
Preparare la soluzione di colorazione CFSE diluendo la colorazione CFSE in 1 mill PBS per rendere il lavoro macrmal out acconsentito. Aggiungere 1 mulino di soluzione di colorazione CFSE nella piastra di imaging per incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius al buio. Aggiungere un uguale di DMEM alle celle più la soluzione di colorazione e lasciare seminare per 5 minuti.
Il prossimo passo è seminare macrofagi di topo RAW2647 e co-coltura con 4T1. Dopo il livellamento CFSE di 4T1 cellule, lavare la scheda di imaging due volte, utilizzando PBS. Seme 2 mulino di sospensione macrofagi in 4T1 piatto di imaging.
Il passo successivo è polarizzare i macrofagi RAW 4627 in finnatipo M1. Aggiungere 2 mulini di mezzi di polarizzazione M1 nel piatto di immaginazione e consentire alle cellule RAW di infondere nel finnatipo del macrofago M1. La seconda parte dello studio è la valutazione time-lapse delle cellule 4T1 fagocite dei macrofagi M1.
Il passo successivo include la valutazione della fagocitosi della microscopia video a cellule vive. Per prima cosa, accendi il microscopio. Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius.
E il 5% di gas di anidride carbonica. Posizionare le celle di co-coltura al centro del palco e avvitare delicatamente sulla camera superiore. Utilizzare il joystick per motorizzare il palco selezionando una posizione diversa da catturare.
Ci sono molti fattori che devono essere considerati durante l'esecuzione di imaging a cellule vive. Per ottenere un video piuttosto piccolo. Richiede l'ottimizzazione dell'esposizione all'imaging, la misurazione del tempo e anche l'automazione della correzione della messa a fuoco.
Nel caso in cui il video sia sovraes esposto, l'intervallo di tempo errato e anche fuori fuoco costerà al video di essere inutilizzabile. La ripetizione dell'esperimento deve essere eseguita se uno di questi fattori è stato rilevato. La figura uno mostra le immunofluorescenze che girano con anti-iNOS in verde.
Marcatore nucleare DAPI in blu. E versioni avanzate della maggior parte delle immagini. Movie 1 è un film rappresentativo in cella dal vivo che comprende macrofagi M1 e 4T1.
Cfse ha macchiato la maggior parte delle cellule carcinomi mammarie catturate utilizzando l'acquisizione multicanale di florescent e la microscopia IC. Film 2 film di microscopia video a cellule vive da multi-punto in un unico piatto coniugale. Mostrando fagocitosi di 4T1 da macrofagi M1 indotti.
Le immagini sono state catturate a intervalli di 50 minuti per 13 ore. Film 3 film di microscopia video a celle live, di un singolo punto di coordinate scelto per mostrare una visualizzazione approfondita della fagocitosi di 4T1 di M1 Macrophages. Frecce rosse mostra ai macrofagi M1, cerchio giallo mostra che un certo numero di cellule 4T1 quench fluorene e goffman di 4T1 cellule.
I macrofagi M1 move-ology descrivono come porocitoplasma erano come carcinomi a memoria di topo 4T1 hanno una morfologia dell'epitelio. I macrofagi possono essere visti muoversi per aggiungere celle 4T1 per stabilire il contatto da cella a cella. Che viene poi seguito dall'assorbimento di 4T1 cellule per macrofagi M1.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione su come eseguire esperimenti di microscopia video a cellule dal vivo;con carcinoma mammario del mouse 4T1 e macrofagi RAW 2647 merad. Dovresti anche essere in grado di impostare durante la notte co-culture di entrambi i tipi di cellule per eseguire un saggio di fagocitosi. Dovresti anche capire come i co-cultuer di 4T1 con LPS e macrofagi interferone-gamma.
