El objetivo general de este estudio es obtener una imagen 2D time-Lapse de la actividad fagocítica en M1 Macrophages 4T1 Mouse Mammary Carcinomas Cells in Co-cultures. El modelo de co-cultivos de células de vida se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. La evaluación de la actividad de la fagocitosis por macrófagos fue imagen;utilizando software de imágenes para duplicar el vídeo multipunto de lapso de tiempo, antes de atesting nuestra incubación.
El asunto que llevamos a cabo a punto de satisfacer las necesidades y beneficios del perfeccionamiento en el comportamiento de los macrófagos y su actividad fagocítica con las células cancerosas. Específicamente en el estudio es el carcinoma mamario de ratón. La primera parte de este estudio comienza con el modelo de co-cultivo de células vivas de células carcinomas mamarias de ratón 4T1 y macrófagos de ratón RAW 2647.
Comience el experimento cultivando 41 células de carcinomas mamarios de ratón y macrófagos de ratón RAW 2647. En primer lugar, descongelar un vial de células 4T1 y RAW 2647. Diluir las células descongeladas en 10 milímetros en un tubo cónico de 15 molinos.
A continuación, centrifugar las células a 660 g de fuerza durante 5 minutos para obtener el pellet celular. Aspirar cuidadosamente los medios, volver a suspender las células en 8 molinos de medios completos y transferir las células al matraz de cultivo de tejido. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5 por ciento de dióxido de carbono.
Después de una semana de cultivo en condiciones adherentes, monitoree el matraz diariamente y complemente con medios completos atmil según sea necesario. El siguiente paso continúa con la inmunosumanidad de los macrófagos POLARizados M1 RAW 2647. Este paso es asegurar una polarización completa de los macrófagos M1.
Como la confluencia de RAW 2647 ha alcanzado entre el 70 y el 80 por ciento desechar los medios de cultivo y enjuagar suavemente dos veces con PBS. Preparar los macrófagos para la recolección desalojar suavemente las células adherentes utilizando un raspador de células y transferirlos a un tubo cónico de 50 molinos. Contar las células mediante el hemocitometómetro y preparar una célula suspensionada a una densidad de 100.000 células por plato mediante la adición de la solución restante a la densidad de asiento.
Sit 2 molinos de suspensión de macrófagos en dos platos de imagen. Incubar las células de 2 a 3 horas a 37 grados centígrados con un 5 por ciento de dióxido de carbono para permitir la adherencia celular. Prepare los medios de polarización M1 añadiendo 100 nilligramas por molino LPS y 20 nilligram por molino de interferón-gamma en un medio completo complementado con 10 por ciento de FBS.
Deseche los cultivos sobrenadantes de los macrófagos incubados antes y lave cuidadosamente las monocapas en el plato dos veces usando PBS. Agregue 2 molinos de medios de polarización M1 en uno de los platos coincidentes y permita que las células dura se infunda en el finnatipo de los macrófagos M1. Antes de la inmunomancha, fije las células de los macrófagos RAW y M1 utilizando 2 molinos de paraformaldehído al 4 por ciento e incubar durante 50 minutos a temperatura ambiente.
Retire el sobrenadante y lave la monocapa de las células usando PBS, al menos tres veces. Se aprieta con 2 molinos de cloruro de amonio de 50 milímetros en PBS e incuba durante 50 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar usando 0.3 por ciento Tritón X-100 en PBS durante 50 minutos a temperatura ambiente.
Paso de bloqueo usando 10 por ciento de FBS durante 30 minutos a temperatura ambiente PBS. Incubar con FITC conjugado con anticuerpos anti-iNOS en PBS y un uno por ciento de FBS durante la noche a 4 grados centígrados. Incubar 1 molino de DAPI en platos de imagen durante 10 minutos a 37 grados Celsius en condiciones oscuras cubriendo con papel de aluminio.
Lave las células usando PBS al menos 3 veces y agregue 1 molino de DMEM en platos a juego y listo para imágenes fluorescentes. El siguiente paso continúa con la siembra de células de carcinomas mamarios de ratón 4T1. A medida que la confluencia de las células 4T1 alcanzan 70 a 80 por ciento deseche los medios de cultivo y enjuague suave dos veces con PBS.
Agregue 1 molino de trippsina precaleada para des-asociar las células y la incubación durante hasta 20 minutos a 37 grados Celsius. Una vez que las células aparezcan des-adjuntadas, transfiera las celdas des-adjuntas a un tubo cónico de 15 molinos. Y añadir 2 molinos de medio completo precale calentado para inactivar el tubo visto.
Centrifugar a 600 g de fuerza durante 5 minutos para obtener un pellet celular. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un medio DMEM de muestreo de precontraje de 10 molinos. Cuente las células utilizando hemocitociómetro y semilla 100.000 células en el molino DMEM.
En imágenes de estos con TC tratado. El siguiente paso es etiquetar las células vivas de los carcinomas mamarios de ratón 4T1 utilizando tinción CFSE. En primer lugar, retire el medio existente de la antena de imágenes que anteriormente se había sembrado con células 4T1.
Prepare la solución de tinción CFSE diluyendo la tinción CFSE en 1 molino de PBS para hacer 5 macrmal out trabajo consentido. Agregue 1 molino de solución de tinción CFSE en un plato de imágenes para incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente o 37 grados centígrados en la oscuridad. Agregue un igual de DMEM a las células más solución de tinción y deje sembrar durante 5 minutos.
El siguiente paso es sembrar macrófagos de ratón RAW2647 y co-cultura con 4T1. Después de la nivelación CFSE de células 4T1, lave el plato de imágenes dos veces, usando PBS. Siembra 2 molinos de suspensión de macrófagos en una placa de imágenes 4T1.
El siguiente paso es polarizar los macrófagos RAW 4627 en el finnatipo M1. Añadir 2 molinos de medios de polarización M1 en el plato imagine y permitir que las células RAW infundir en el finnatipo de macrófago M1. La segunda parte del estudio es la evaluación de lapso de tiempo de las células 4T1 fagocias M1.
El siguiente paso incluye la evaluación de la fagocitosis de la microscopía de video de células vivas. Primero, encienda el microscopio. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.
Y 5 por ciento de gas de dióxido de carbono. Coloque las células de co-cultivo en el centro del escenario y atornille suavemente la cámara superior. Utilice el joystick para motorizar el escenario seleccionando la posición diferente para ser capturada.
Hay muchos factores que deben tenerse en cuenta al realizar imágenes de células vivas. Para obtener un video bastante pequeño. Requiere optimización de la exposición a imágenes, medición del tiempo y también automatización de la corrección del enfoque.
En caso de que el vídeo esté sobre expuesto, el intervalo de tiempo incorrecto, y también fuera de foco, costará que el vídeo sea inutilizable. Es necesario repetir el experimento si se ha detectado uno de estos factores. La figura uno muestra inmunofluorescencias girando con anti-iNOS en verde.
Marcador nuclear DAPI en azul. Y versiones mejoradas de la mayoría de las imágenes. Movie 1 es una película representativa de células en vivo de comprensión de los macrófagos M1 y 4T1.
CFSE tiñe la mayoría de los cultivos conjunto de células de carcinomas mamarios capturados mediante la adquisición multicanal de florescente y la microscopía IC. Película 2 películas de microscopía de vídeo de células en vivo de varios puntos en un solo plato conyugal. Mostrando fagocitosis de 4T1 por macrófagos M1 inducidos.
Las imágenes fueron capturadas a intervalos de 50 minutos durante 13 horas. Película 3 película de microscopía de vídeo de células vivas, de un único punto de coordenadas elegido para mostrar una visualización en profundidad de la fagocitosis de 4T1 por M1 Macphages. Las flechas rojas muestran los macrófagos M1, el círculo amarillo muestra que un número de células 4T1 calman el flúor y el goffman de las células 4T1.
M1 macrófagos move-ology describe como porocitoplasmo fueron como 4T1 carcinomas de memoria de ratón tienen una morfología de epitelio. Los macrófagos se pueden ver moviéndose para agregar celdas 4T1 para establecer el contacto de celda a celda. Que luego es seguido por la absorción de 4T1 células por macrófagos M1.
Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión sobre cómo realizar experimentos de microscopía de video de células en vivo;con carcinoma mamario de ratón 4T1 y macrófagos DE merad RAW 2647. También debe ser capaz de configurar sobre los co-cultivos nocturnos de ambos tipos de células para realizar ensayos de fagocitosis. También debe entender cómo los co-cultuers de 4T1 con LPS y macrófagos interferón-gamma.
