Общая цель этого эссе, является подготовка макрофагов и опсонизированных красных кровяных телец для визуализации фагоцитоза трехмерной микроскопии промежуток времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как, как фагоциты захвата и ingest частиц. Этот метод позволяет визуализировать поглощение частиц в режиме реального времени, в отличие от более традиционных анализов конечных точенок, которые позволяют только оценить, является ли, но не как, частица была попадает.
Как правило, люди, новые для этого метода могут бороться, пока они не приучаются к процедурам изоляции клеток. Впервые у нас возникла идея для этого метода, когда мы поняли преимущества спиннинг этой конфокальные микроскопии для 3D замедленной визуализации фагоцитоза. Чтобы изолировать перитонеальные макрофаги, поместите 24 калибровочный пластиковый катетер в брюшной полости трех-четырехмесячной мыши, и использовать пластиковый пятими миллилитровый шприц, чтобы помять полость в два раза с 4,5 миллилитров ледяного HBSS без кальция и магния на лаваж.
Передача аспирированной суспензии в 14-миллилитровый полипропилен круглой нижней трубки, как он собирается. Когда оба образца были собраны, центрифуга аспирата, и повторно использовать брюшной клетки в один миллилитр полного бикарбоната свободной RPMI 1640 среды для достижения около шести раз от 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации. Далее, чтобы предварительно заполнить слайды добавить один миллилитр полного HEPES дополнены среды к одному резервуару фибронектина покрытием слайд канала, и наклон слайд, чтобы среда будет аспирирована из вниз по течению водохранилища.
Чтобы удалить нежелательные пузырьки воздуха, добавьте от одного до двух миллилитров свежей среды в один из двух резервуаров и плотно нанесите крышку резервуара. Затем нанесите ритмичное давление большого пальца на крышку, чтобы выкачать любой воздух из слайда, наклоняя слайд по мере необходимости. Когда весь воздух будет изгнан, наклоните горку к необнаженной среде, содержащей резервуар, и снимите крышку, чтобы избежать всасывки воздуха обратно в канал.
Теперь пипетка клеточного раствора несколько раз, чтобы уменьшить слипание, и добавить 100 микролитров клеток в один канал слайда в течение двух часов инкубации во влажной камере при 37 градусов по Цельсию при отсутствии углекислого газа. В конце инкубации замените HEPES, содержащий среду в каждом слайде, полным бикарбонатным дополнением среды, как только что продемонстрировано. Затем поместите клетки в 37 градусов по Цельсию влажный инкубатор с 5%carbon диоксида для их ночной культуры.
На следующее утро перенесите один миллилитр свежеприготовленной здоровой донорской крови в двухми миллилитровую круглую полипропиленовую микроцентрифугную трубку. Затем центрифуга образца. Удалите плазму и баффи пальто, содержащее супернатант.
И тщательно передать 100 микролитров осадочных красных кровяных телец в два миллилитров mircocentrifuge трубки, содержащие 100 микролитров полного HEPES дополнены среды. Этикетка трубки 1:1 и передачи четырех микролитров разбавленных красных кровяных телец в новый двухми миллилитр микроцентрифуг трубки, содержащей два миллилитров полного HEPES дополнены среды. Затем обозначить эту трубку 4:2000 и поместить как разбавленные красные трубки образца крови на льду.
Для маркировки перитонеальные макрофаги заменяют бикарбонатную среду в каждом слайде канала полными средами, дополненными HEPES. Затем наклоните слайд, чтобы позволить 100 микролитров флуоресцентно помечены мыши макрофаг конкретных антител, представляющих интерес, которые будут добавлены падение мудрым к открытию 100 микролитровый канал слайда. Аспирировать среду, которая впадает в резервуар вниз по течению, и инкубировать клетки в течение 20 минут во влажной камере при 37 градусах по Цельсию при отсутствии углекислого газа.
В то время как брюшной клетки в настоящее время помечены мягко смешать 4:2000 красных кровяных телец образца и передачи 400 микролитров клеток в новый двухми миллилитр микроцентрифуг трубки, в нагретом алюминиевом блоке внутри ламинарного капюшона потока в течение примерно пяти-восьми минут. Когда клетки прогрелись до 37 градусов по Цельсию смешать 0,4 микролитров соответствующих красных флуоресцентных плазменных мембран пятно с клетками. Затем поместите клетки обратно в тепловой блок.
Через пять минут промыть клетки, добавив 1,6 миллилитров свежего HEPES дополнены полной среды и центрифуги. Поверните трубку, чтобы определить гранулы красных кровяных телец. Используя один до 1,5 миллилитров пипетки наконечник тщательно удалить супернатант в двух томах, не нарушая гранулы и смешать 2000 микролитров свежих HEPES дополнены полной среде с клетками.
Центрифуга и повторно приостановить гранулы в 400 микролитров среды. Затем этикетка трубки ПМС для плазменной мембраны пятно. В конце 20-минутной перитонеальной клеточной маркировки инкубации мыть слайд с одним миллилитром свежей полной HEPES дополненной среде.
Для опсонизации красных кровяных телец добавьте один микролитер мыши IGG2B моноклонального анти человеческого CD235A антитела к pmS образца трубки. После восьми минут при 37 градусах по Цельсию с смешиванием один раз в минуту передача 100 микролитров плазменной мембраны окрашенных IGG opsonized человеческих красных кровяных телец в перитонеальный макрофаг, содержащий слайд канала. Как только красные кровяные тельца человека были добавлены смонтировать слайд на вращающемся диске конфокального микроскопа.
С этапом инкубатор установлен до 37 градусов по Цельсию и сразу же начать визуализацию клеток. Промежуток времени 3D-изображение зеленых флуоресцентных макрофагов, представленных красными флуоресцентными красными кровяными клетками человека, позволяет визуализировать фагоцитные события одной частицы. Например, можно наблюдать захват мыши IGG, опсонизированной человеческой красной кровяной клеткой макрофагом филоподия.
А также, сжатие человеческих красных кровяных телец во время формирования фагоцитовой чашки. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как изолировать мышь резидентов перитонеальные макрофаги, флуоресцентно помечены клетки, и opsonized частиц.
