המטרה הכוללת של מחקר זה היא להשיג זמן לשגות 2D הדמיה של פעילות Phagocytic ב M1 מקרופאגים 4T1 עכבר Mammary קרצינומות תאים בתרבויות שיתוף. מודל תאי החיים לתרבותות שותף הוקם ונצפתה באמצעות שילוב של מיקרוסקופיה של ניגודיות פלורסנט והפרעה דיפרנציאלית. ההערכה של פעילות phagocytosis על ידי מקרופאגים היו תמונה; באמצעות תוכנת הדמיה להכפיל את זמן רב לשגות וידאו, לפני להעיד הדגירה שלנו.
העניין שערכנו עומד למלא את הצרכים והיתרונות של ההתחדדות בהתנהגות המקרופאגים ובפעילותו הפגוציטית עם תאים סרטניים. באופן ספציפי במחקר הוא קרצינומה של קרצינומה של עכבר. החלק הראשון של מחקר זה מתחיל עם תאים חיים שיתוף תרבות מודל של 4T1 עכבר החלב קרצינומות תאים RAW 2647 מקרופאגים העכבר.
התחל את הניסוי על ידי culturing 41 עכבר קרצינומות קרצינומות תאים ו RAW 2647 מקרופאגים העכבר. ראשית, להפשיר בקבוקון של 4T1 ו RAW 2647 תאים. לדלל את התאים המופשרים ב 10 מילימטר בצינור חרוט 15 מ"מ.
הבא, צנטריפוגה התאים ב 660 כוח גרם במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה התא. בזהירות לשאיף את התקשורת, להשעות מחדש את התאים ב 8 טחנת מדיה מלאה ולהעביר את התאים לתוך בקבוק תרבות הרקמות. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז פחמן דו חמצני.
לאחר שבוע של culturing בתנאים חסידים, לפקח על הבקבוק מדי יום, תוספת עם מדיה מלאה atmil לפי הצורך. השלב הבא ממשיך עם הכשל החיסונים של מקרופאגים מקוטבים M1 RAW 2647. שלב זה הוא להבטיח קיטוב מלא של מקרופאגים M1.
כמו הקונפדרציה של RAW 2647 הגיע 70 עד 80 אחוזים להשליך את התקשורת התרבותית בעדינות לשטוף פעמיים עם PBS. הכן את המקרופאגים לאיסוף על-ידי פירוק עדין של התאים החסידיים באמצעות מגרד תאים והעברה לצינור חרוט של 50 מ"ל. לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהכין תא תלוי בצפיפות של 100, 000 תאים לכל צלחת על ידי הוספת הפתרון הנותר לצפיפות הישיבה.
לשבת 2 טחנה של השעיית מקרופאגים לשתי מנות הדמיה. דגירה התאים 2 עד 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז פחמן דו חמצני כדי לאפשר דבקות התא. הכן מדיית קיטוב M1 על-ידי הוספת 100 ניליגרם לטחנת LPS ו- 20 ניליגרם לטחנת אינטרפרון-גמא למדיום שלם בתוספת 10 אחוז FBS.
השליכו את התרבויות על-טבעיות ממאקרופאגים שהו דגירה לפני ולשטוף בזהירות את המונוליירים בצלחת פעמיים באמצעות PBS. הוסף 2 טחנה של מדיה קיטוב M1 לתוך אחד הכלים התואמים ולאפשר לתאי דורה להחדיר לתוך M1 מקרופאגים פינאטיפ. לפני כשל חיסוני, לתקן תאים מקרופאגים RAW ו- M1 באמצעות 2 טחנת 4 אחוז paraformaldehyde ודגירה במשך 50 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את supernatant ולשטוף את התאים monolayer באמצעות PBS, לפחות שלוש פעמים. מרווה עם 2 מ"ל של אמוניום כלוריד 50 מ"מ ב- PBS ודגירה במשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize באמצעות 0.3 אחוז טריטון X-100 ב PBS במשך 50 דקות בטמפרטורת החדר.
צעד חסימה באמצעות 10 אחוז FBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר PBS. דגירה עם נוגדנים נגד iNOS גדוש FITC ב PBS ואחוז אחד FBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס. דגירה 1 טחנה של DAPI לתוך כלי הדמיה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס במצב כהה על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום.
לשטוף תאים באמצעות PBS לפחות 3 פעמים ולהוסיף 1 טחנה של DMEM לתוך מנות תואמות ומוכן הדמיה פלואורסצנטיים. השלב הבא להמשיך עם זריעה של 4T1 עכבר קרצינומות תאים. כמו הקונפדרציה של תאים 4T1 להגיע 70 עד 80 אחוז להשליך את התקשורת התרבותית ולשטוף בעדינות פעמיים עם PBS.
הוסף 1 טחנה של טריפסין מחומם מראש כדי לשייך את התאים דגירה עד 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים נראים לא מחוברים, מעבירים את התאים שאינם מחוברים לצינור חרוטי של 15 מ"מ. ולהוסיף 2 טחנה של מדיום שלם מחומם מראש כדי להשבית את הצינור לראות.
צנטריפוגה ב 600 כוח גרם במשך 5 דקות כדי לקבל גלולה תא. הסר את גלולת העל-טבעית והשהה אותה מחדש בדגימה מוקדמת של 10 מ"ל של דגימת DMEM. לספור את התאים באמצעות hemocytometer וזרע 100, 000 תאים לתוך טחנת DMEM.
לתוך הדמיה אלה עם TC מטופלים. השלב הבא הוא תיוג חי 4T1 עכבר קרצינומות תאים באמצעות כתמי CFSE. ראשית, הסר את המדיה הקיימת מצלחת ההדמיה שזרעה בעבר עם תאי 4T1.
הכן פתרון הכתמים CFSE על ידי דילול כתמי CFSE ב 1 מיל PBS כדי להפוך 5 macrmal החוצה עובד בהסכמה. הוסף 1 טחנה של פתרון הכתמת CFSE לתוך צלחת הדמיה כדי דגירה תאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס בחושך. הוסף שווה של DMEM לתאים בתוספת פתרון הכתמים ולאפשר זרע במשך 5 דקות.
השלב הבא הוא לזרוע מקרופאגים של עכבר RAW2647 ותרבות-שותף עם 4T1. לאחר החלקת CFSE של 4T1 תאים, לשטוף את צלחת ההדמיה פעמיים, באמצעות PBS. זרעים 2 טחנת מקרופאגים השעיה לתוך צלחת הדמיה 4T1.
השלב הבא הוא לקטב מקרופאגים RAW 4627 לתוך M1 פינאטיפ. הוסף 2 טחנת מדיה קיטוב M1 לתוך צלחת לדמיין ולאפשר לתאי RAW להחדיר לתוך פינאטיפ מקרופאג M1. החלק השני של המחקר הוא הערכת זמן לשגות של M1 מקרופאגים phagocyted 4T1 תאים.
השלב הבא כולל הערכת מיקרוסקופיה של וידאו בתא חי. ראשית, הפעל את המיקרוסקופ. הגדר טמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס.
ו-5 אחוז גז פחמן דו חמצני. מקם את תאי התרבות השותף במרכז הבמה והברג בעדינות על התא העליון. השתמש בהיגוי כדי לנענע את הבמה על-ידי בחירת מיקום שונה ללכידתו.
ישנם גורמים רבים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הדמיה של תאים חיים. כדי להשיג וידאו די קטן. זה דורש אופטימיזציה של חשיפה להדמיה, מדידת זמן וגם תיקון מיקוד אוטומטי.
במקרה הווידאו הוא מעל חשוף, מרווח זמן שגוי, וגם מחוץ לפוקוס, יעלה את הווידאו להיות שמיש. חזרה על הניסוי צריכה להיעשות אם אחד מגורמים אלה זוהה. איור אחד מראה שפעת חיסונית מסתובבת עם אנטי-iNOS בירוק.
DAPI סמן גרעיני בכחול. וגרסאות משופרות של רוב התמונות. סרט 1 הוא סרט תא חי מייצג של הבנת מקרופאגים M1 ו 4T1.
CFSE מוכתם ביותר תאי קרצינומה ממארי שיתוף תרבויות שנתפסו באמצעות רכישה רב ערוצית של פלורסנט מיקרוסקופיה IC. סרט 2 סרטי מיקרוסקופ וידאו בשידור חי מרובי נקודות בצלחת התייחדות אחת. מראה phagocytosis של 4T1 על ידי מקרופאגים M1 המושרה.
התמונות צולמו במרווחים של 50 דקות במשך 13 שעות. סרט 3 סרט מיקרוסקופ וידאו חי תא, של נקודת קואורדינטות אחת שנבחרה להראות הדמיה מעמיקה של phagocytosis של 4T1 על ידי מקרופאגים M1. חצים אדומים מראים מקרופאגים M1, עיגול צהוב מראה כי מספר תאים 4T1 מרווה פלואורן וגופמן של תאים 4T1.
M1 מקרופאגים לנוע-ology לתאר כמו porocytoplasm היו כמו קרצינומות זיכרון העכבר 4T1 יש מורפולוגיה אפיתל. ניתן לראות מקרופאגים נעים כדי להוסיף תאי 4T1 כדי ליצור קשר בין תא לתאים. לאחר מכן, לאחר מכן ספיגת תאי 4T1 לכל מקרופאגים של M1.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה על איך לבצע ניסוי מיקרוסקופי וידאו בתא חי;עם קרצינומה של 4T1 עכבר החלב RAW 2647 מקרופאגים מראד. אתה צריך גם מסוגל להגדיר על תרבויות לילה של שני סוגי התאים לבצע חיבור phagocytosis. אתה צריך גם להבין על איך co-cultuers של 4T1 עם LPS ומאקרופאגים אינטרפרון-גמא.
