В многоклеточных организмах ткани еще больше демонстрируют высокую степень пространственной ориентации. Клетки выравнивают и отображают диапазон приоритетов на больших расстояниях в течение морфогенеза. Чтобы понять, как планарные механизмы эпителии достигнут во время развития, очень важно отслеживать ориентации клеток и динамику роста с высоким пространствевой временной верности виво.
Описанный протокол предназначен для изображения и анализа поведения клеток на глобальном и местном уровнях в дрозофиле пупка эпидермиса. Эта методология может дать представление о различных теориях исследований, клеточной биологии, морфогенеза и планарной полярности и может быть применена к анализу других тканей, структур и моделей. Все шаги могут быть выполнены легко после некоторой практики.
Они требуют точности. Визуализация этого протокола помогает достичь оптимальных результатов в более короткие сроки. Рассечение щенков является сложным.
Для начала используйте увлажненный кисть, чтобы перенести постановочные белые предварительно куколки в свежий пластиковый флакон, и держать их там до тех пор, как это необходимо при 25 градусов по Цельсию. Затем удалите каждую куколку со стенки флакона с помощью типсов. Клей брюшной стороне каждой куколки на стеклянной слайд, покрытый двусторонним липкой лентой.
Аккуратно нажмите на голову spiracles и спинной поверхности куколки с кончиками типсов, чтобы обеспечить адгезию куколки случае ленты. Начните рассечение под стерео микроскопом, аккуратно удалив оперкулум из пупариума с помощью типсов. Вставьте один кончик типса на мелководье между корпусом куколки и поверхностью куколки через оперкулярное отверстие.
Разорвать случае с головы до хвоста боковой в одном или несколько качелей, избегая щипать куколку. Сложите обратно трещины куколки случае боковых сторон, как вы продолжаете приступить к задней части. Удалите куколку из открытого кукольного корпуса, тщательно вставив типсы под животное и аккуратно потянув вверх.
Куколка прилипает к кончику типса. Держите куколку осторожно на брюшной стороне, и передать куколку в стеклянное дно блюдо на вершине небольшой капли газоназного галоуглеродного масла. Ролл кусок мокрой бумаги ткани по краям блюдо и покрыть блюдо для поддержания влажности.
Ориентируйте куколку на каплю масла на стеклянные блюда с дном в зависимости от домена и процесса, который необходимо оценить. Для долгосрочной живой визуализации раннего расширения спинных гнезд, спинной боковой ориентации куколки. Чтобы изображение их позднего расширения и ткани ремоделирования, dorsally ориентировать куколку.
Перенесите стеклянную дном тарелку, содержащую установленные куколки, на стадию микроскопа и сосредоточьтесь на поверхности брюшной полости с помощью передаваемого света. Чтобы использовать митотические рекомбинации, чтобы вызвать генетические мозаики в брюшной эпителия, подготовить девственных женщин проведения теплового шока неизгладимый flipase, FRT сайт в определенном геномном месте, и узнаваемый клеточный маркер дистал к FRT сайте. Подготовь самцов-мутантов, несущих FRT-сайт в эквивалентном геномном месте.
Крест несколько женщин и мужчин в три к одному пропорции в пластиковый флакон при 25 градусов по Цельсию в течение четырех-пяти дней. Для генерации соматических клонов в гистобластах, выполните обработку теплового удара на третьей стадии личинки звезды потомства креста, погружая пластиковые флаконы, содержащие животных в водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут до часа. В программном обеспечении изображения J используйте функцию проекции максимальной интенсивности для защиты срезов стеков, приобретенных с помощью конфоканной микроскопии в 2D.
Гнезда имеют характерную форму, которая ориентирует их в систему планарных координат передней слева и спинной к вершине. Для достижения оптимальных результатов с помощью этого анализа входное изображение должно быть получено с высоким разрешением. Чтобы получить качественные значения ориентации на локальных краях ячеек, нажмите на меню плагина и выберите вариант распределения ориентации J.
Установите сигму окна Гауссиана до одного пикселя, кубический сплайн к градиенту, минимальную согласованность до 20 процентов и минимальную энергию до одного процента. Иеготовите опцию цветового обследования плагина. Установите оттенок ориентации, насыщенности согласованности и яркости для ввода изображения.
Этот цвет кодирует ориентации края ячейки относительно установленной системы планарных координат. Далее, в меню плагина, используйте опцию измерения ориентации J для количественной оценки клеточной ориентации и направленной ячейки к выравниванию клеток. Создать небольшие, прилегающие неперекрывающиеся области, представляющие интерес для равномерного веса около 20 микрометров раз 20 микрометров в пределах площади, занимаемой гистобластов.
Мера нажатия вычисляет доминирующую местную ориентацию и согласованность от ROIs. В этом исследовании используемая методология способна генерировать фильмы с высоким разрешением развивающихся куколок в течение периодов до 48 часов без значительного отбеливания фотографий или фототоксичности. Примеры клонов дикого типа, отмеченные отсутствием RFP NLS и их двойных пятен через 26 часов после образования пупариума, показаны здесь.
Клоны удлинены вдоль сегментальных границ. Двойные клоны расположены параллельно или в тандеме. Морфология клона дикого типа через 26 часов и 47 часов после образования пупариума показывает сложную морфологию границ на обоих стадиях.
Участки коробки и усов для геометрических параметров через 26 часов и 47 часов после образования пупария показывают, что усредненные площади и периметр значительно увеличились в это время окна. Ориентация клона была поддержана во время расширения и реконструкции. Параметры формы через 26 часов и 47 часов после образования пупария указывают на шероховатости, округость и круговорот, практически не меняемые в клонах дикого типа.
Будьте уверены, чтобы не повредить куколку, в противном случае он умрет в течение нескольких часов, влияющих живой изображения. Этот протокол не требует использовать реагент сарта или инструмент. Избегайте щипать себя при вскрытии.
Применяя эти методологии можно генерировать фильмы с высоким разрешением в течение длительных периодов времени с использованием различных методов представить. Фокус для фотона или вращающихся дисков. Хлоральный анализ может быть использован для изучения неавтономных реакций, поскольку случайные клетки облегчают идентификацию перекрестных переговоров или механизмов сотовой связи.
Эти методы могут быть легко адаптированы для изучения полного спектра морфогенетических явлений, включая координацию эпидермального, мышечного и нейроразвития во время метаморфоз.
