Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда.

1. День 1 Прежде чем вы начнете: Здоровой популяции мух следует поддерживать с помощью стандартных протоколов культивирования: удалите взрослых из бутылок или флаконов после 3-4 дней яйцо лежало и позволит продолжить развитие при постоянной температуре до блуждающих 3-го возраста личинки инициировать pupariation. Личиночной / куколки переход отмечен образованием предкуколок (считается 0 часов после пупария образование-ФПА). Неподвижные куколки отличаются от старых куколки их белую окраску и из личинки, которые еще не начали pupariation их продолговатые, округлые формы и выпячивание передней дыхальца. Вам понадобятся: <ul><li> Кисть для сбора куколки </li><li> Влажной камере для культивирования куколки: чашки Петри выложены смоченный бумажным полотенцем и покрыта фильтровальной бумаги отмечены для различных временных точках сбора, генотип или пол куколки </li><li> 1X фосфатным буферным раствором (PBS) для мытья куколки </li></ul> Коллекция, культивирования и постановка куколки <ol><li> Использование смоченный кистью аккуратно удалить 0hr APF куколки от культуры бутылок / флаконов и разместить их в крышку влажной камере. </li><li> Использование кисти и 1X PBS аккуратно мыть куколки для удаления мусора от случая куколки </li><li> При необходимости сортировать куколки по полу. Гонады зачатков куколки могут быть использованы для сортировки полов. Мужской зачатков гонад являются боковые пары полупрозрачных дисков легко видеть через кутикулу куколки около 2 / 3 всей длине тела 5. Женских зачатков гонад меньше и не так легко определить. </li><li> Место куколок в соответствующей маркировкой позиции в влажной камере и вернуться к постоянной температуре. Культура в соответствующий момент времени развития. </li></ol> 2. День 2: Dissection, фиксация и первичный инкубации антитела Прежде чем вы начнете: Вам понадобятся: <ul><li> Препарирование стереомикроскопа </li><li> Хирургические щипцы </li><li> Хирургический скальпель с номером 11 лопастей </li><li> Два из девяти и стекла депрессии блюд (Corning продукт # 7220-85) <ul><li> Заполните скважин одно блюдо с 1X PBS: Это полоскание блюдо для очистки расчлененный куколки </li><li> Заполните скважин второе блюдо с фиксацией буфер </li></ul></li><li> Влажная камера для антител инкубации. Мы используем пластиковые герметичные ящики сэндвич выложены смоченный бумажные полотенца. </li><li> Фиксация буфера: 1x PBS, 4% параформальдегида, 0,2% deoxycholic кислоты (пермеабилизации) </li><li> Препарирование платформы: Ясно микроскопический слайд с кусочком двухсторонней ленты придерживался одной стороне </li><li> 1X PBS </li><li> P100 или P200 пипетка </li></ul> Рассечение <ol><li> Использование пинцета аккуратно удалить куколки по одному и разместить их на вскрытии платформы с передним концом куколки перед широкой ширины ленты. Если куколки чрезмерно влажным, первый смоет их насухо бумажным полотенцем. </li><li> Перед куколки полностью придерживался ленты, используйте кисть, чтобы установить их. </li><li> Разрешить куколки высохнуть на воздухе и придерживаться ленты (5-10 минут) </li><li> С хирургическим скальпелем рассекают каждой куколки на двусторонней основе. Лучше всего это достигается с помощью одного быстрого, вырезанные из переднего к заднему концу куколок. Если правильно сделать, сокращения будут делить пополам обе передние и задние дыхальца пар. Рассеките не более 10 куколки в то время, как умывание и чистка образцы быстро необходимо для предотвращения протеолитического повреждения тканей. </li><li> Использование кисти, передача небольшого количества 1X PBS каждому расчлененный куколки, чтобы ослабить их от ленты. </li></ol> Уборка, фиксация и первичный инкубации антитела <ol start="6"><li> С парой хирургических щипцов понять отдельные half куколки вперед и сразу же погрузить его в колодец полоскания блюдо. Рассечение платформа должна быть заменена полоскания блюдо на столик микроскопа. Случае куколки должны быть оставлены на образце до завершения обработки и образцы готовы для монтажа. </li><li> Еще захватывая половину куколки использовать пипетки, чтобы аккуратно смыть внутренние ткани живота. Слишком большое давление во время стирки может привести к потере эпителиальных клеток. </li><li> Сразу передачи чистой half куколки к фиксации буфера при комнатной температуре и обработки оставшихся половин куколки аналогично. С практикой, рассечение и мойки 20 половин куколки должно занять менее 5 минут. </li><li> Разрешить куколки для инкубации в фиксации буфера при комнатной температуре в течение 1 (одного) часа. </li><li> Промыть фиксированной куколки 3x пять минут в 1X PBS </li><li> Пробы могут быть немедленно обработаны для иммуногистохимии или могут быть сохранены на 100% этанола при -20 ° С в течение 3 месяцев без потери клеток или эпитопа реактивности. </li><li> Для хранения образцов, равновесие образцов путем разбавлениясерии PBS: этанол (3:1, 1:1, 1:3) при комнатной температуре в течение 20 минут в каждом разбавлении до перехода на 100% этанола. </li><li> Образцы должны быть повторно уравновешенную PBS через обратный серии перед обработкой для иммуногистохимии. </li><li> Блок образцов в 1x PBS (с добавлением 2% бычий сывороточный альбумин) на 1 (один) час до того первичных антител. </li><li> Инкубируйте с первичным антителом разводят до соответствующей концентрации в 1X PBS в течение ночи при 4 ° С без раскачивания. </li></ol> 3. День 3: Среднее инкубации антитела, монтажа и обработки изображений Прежде чем вы начнете: Вам понадобятся: <ul><li> Два хирургических щипцов </li><li> Монтаж средств массовой информации (глицерин, Vectashield [Векторная Labs], или Slowfade Золото [Invitrogen]) </li><li> Депрессия также слайды микроскопом (0,8 мм) </li><li> Покровные стекла (24 х 40 мм) </li></ul> Вторичные инкубации антитела и монтаж: <ol><li> Вымойте образцы 3x 10 минут каждая с 1x PBS </li><li> Блок образцов в 1x PBS (с добавлением 2% бычий сывороточный альбумин) на 1 (один) час до того вторичных антител. </li><li> Инкубируйте с вторичными антителами разводят до соответствующей концентрации в 1X PBS при комнатной температуре в темноте без раскачивания течение 3 (трех) часов. </li><li> Вымойте образцы 3x 10 минут каждая с 1x PBS </li><li> Если это уместно, контрастирующая куколки (пример мы пятно ядер с DAPI [4 &#39;,6-diamidino-2-фенилиндола] разводят в PBS в течение 10 минут). </li><li> Равновесия образцов (не менее 30 минут) в соответствующих средствах массовой информации до начала монтажа. </li><li> Подготовка образцов слайдов. Морфология куколки предотвращает плоский монтаж. Образцы устанавливаются в скважине депрессию слайд (падение слайд) для работы с изображениями. Место 75-100 мкл монтажа средств массовой информации в депрессии хорошо. Несколько образцов может быть установлен на одном слайде. </li><li> Случае куколки должны быть удалены из образцов до монтажа. Возьмитесь отдельном случае куколка вперед будучи уверенным, что не понять внутренние куколки мембраны. </li><li> С второй парой щипцов осторожно понять внутренние куколки мембраны голову и удалить его из куколки случае. </li><li> Сразу передачи образца депрессия хорошо и продолжить обработку дополнительных образцов. </li><li> Использование зонда или пинцетом положение образцы равномерно в депрессии и с боковой поверхностью вверх. Иногда пузырьки воздуха могут быть удалены с помощью зонда. </li><li> Осторожно опустите покровное на образцы заботясь, чтобы не вводить пузырьков воздуха </li></ol> 4. Представитель результаты: Образцы, приготовленные с помощью этого протокола сохраняют валового морфологии взрослых живота. Изображение стеки могут проецироваться для создания двумерного изображения или 3-D рендеринга могут быть применены для исследования брюшной полости топологии. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Сегментация продуктов генов у дрозофилы куколки Wingless белка и Engrailed выражение (En-GAL4: UAS-GFP). Визуализировались в 26 час после пупария образования (НПФ) с помощью мыши анти-Wg (4D4: Айова Гибридома банк) и анти-GFP. 10-кратным увеличением, передняя остается и спинной вверх. Nucleii были контрастно с DAPI. Стеки около 50 изображений (ΔZ между среза 2,5 мкм) были спроектированы.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Методы, представленные в этом видео можно использовать для подготовки дрозофилы куколки из различных временных точках развития. Куколки обрабатываются в течение 24 часов APF до 32 часов АПФ наиболее подвержены потерю клеток из эпителия. Использования моющих средств (например, тритон Х-100 и Твин-20) во время длительного инкубационного шаги увеличивает вероятность потерю клеток, и поэтому не рекомендуется. Скорее, deoxycholic кислота используется в качестве моющего средства на первоначальном этапе фиксации. Все последующие шаги выполняются в 1X PBS без моющего средства. Кроме того, покачиваясь образцов при длительном шаги инкубации увеличивает потерю клеток и их следует избегать. Образцы могут быть отображены с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, дрозофилы куколки обрабатывается, как описано может также быть отображены с помощью структурированной системы микроскопии освещения уступая качество изображения сравнимо с конфокальной техники.

<ul><li> Препарирование стереомикроскопа </li><li> Хирургические щипцы </li><li> Хирургический скальпель с номером 11 лопастей </li><li> Девять хорошо стекла депрессии блюд (Corning продукт # 7220-85) </li><li> Влажная камера для культивирования куколки </li><li> 1X фосфатным буферным раствором (PBS) </li><li> # 11 хирургического скальпеля </li><li> двухсторонней ленты </li><li> Фиксация буфера: 1x PBS, 4% параформальдегида, 0,2% deoxycholic кислоты (пермеабилизации) </li><li> P100 или P200 пипетка </li><li> Депрессия также слайды микроскопом (0,8 мм) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

Живот дрозофилы куколки является признанным модельной системы для изучения морфогенеза эпителиальных и развитие половой диморфизм морфологии 1-3. Во время окукливания, который охватывает около 96 часов (при 25 ° С), пролиферирующие популяций имагинальных клетки заменить личиночной эпидермиса генерировать взрослых брюшных сегментов. Эти имагинальных клеток, родившихся в период эмбриогенеза, существует как боковые пары histoblast гнезда в каждом брюшной сегмент личинок. Четыре пары histoblast гнезда приводят к взрослой спинной кутикулы (передний и задний спинной гнезда), вентральной кутикулы (вентральной гнезда) и дыхальца, связанные с каждым сегментом (дыхало гнезда) 4. По puparation, эти диплоидных клеток (отличить по размеру от больших полиплоидных личиночных клеток эпидермиса-МИК) начинают стереотипных процесс пролиферации, миграции и замена МИК. Различные молекулярные и генетические инструменты могут быть использованы для исследования вклада генетических путей, участвующих в морфогенезе взрослых живота. Окончательный фенотипы взрослых, как правило, проанализированы следующие вскрытия брюшной взрослого кутикулу. Тем не менее, исследование основных молекулярных процессов требует иммуногистохимического анализа куколки эпителия, которые представляют уникальные проблемы. Временно динамического формообразования и взаимодействия двух различных популяций эпителия (личиночные и имагинальные) порождают хрупкой ткани склонны к чрезмерной потере клетки во время вскрытия и последующей обработки. Мы разработали методы вскрытия, фиксации, монтажа и визуализации abdominem дрозофилы куколки эпителия для иммуногистохимического исследования, которые создают постоянное высокое качество образцов подходит для конфокальной или стандартной флуоресцентной микроскопии.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry at JoVE.com

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Антитела окрашивание<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки могут повысить генетический анализ взрослых брюшной развития генетики. Представляем вашему вниманию протокол вскрытия, фиксации и окрашивания антител постановочных<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки живота.

Дрозофилы куколки Живот Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.1K Views.  University of Alabama. Антитела окрашивание Drosophila Куколки могут повысить генетический анализ взрослых брюшной развития генетики. Представляем вашему вниманию протокол вскрытия, фиксации и окрашивания антител постановочных Drosophila Куколки живота.

Video: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Тонкие секционирования фрагмент Подготовка к Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

В месте Протокол крылья бабочки куколки Использование Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunohistochemistry: Парафин частей с помощью Vectastain ABC Kit Векторные Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Иммуногистохимии на парафиновых срезах Мыши Эпидермис Использование флуоресцентных антител

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Изображений Через куколки случае<em&gt; Дрозофилы</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Экс естественных Культура Drosophila куколки яичка и одного мужчины зародышевой линии кисты: Вскрытие, Imaging, и фармакологическому лечению

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Вскрытие и Монтаж<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколочные глаз Диски

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...