Использование этой эндотелиальной клеточной культуры позволяет усвоить ситуацию в кровотоке. И в этой ситуации мы можем проанализировать процессы бактериальной инфекции, включая выявление бактериальных переносчиков, а также клеточных переносчиков, которые участвуют в этом процессе. Этот метод прокладывает путь к изучению влияния бактериальных инфекций на целостность сосудов, включая влияние на механизмы морфогенеза, на реакцию воспаления и иммунную регуляции.
Этот метод требует специальной обработки эндотелиальных клеток и, следовательно, визуальное описание лучше, чем просто устное объяснение. Этот метод дает представление о ряде других областей исследований, коррелирующих с перфлитированных сосудистых систем, таких как эндотелиальная дифференциация клеток, заживление ран, генезис опухоли и ангиогенез. Одним из ключевых шагов является стандартизированное культивирование клеток, а также точная обработка первичных эндотелиальных клеток.
Этот метод требует некоторых специальных обработки клеточной культуры, которые не могут быть ясны только словесные объяснения. Для начала работайте в стерильной среде с помощью чистой скамейки. Используйте пипетку, чтобы впрыснуть 100 микролитров 2%-стерильного фильтрованного свиного желатина PBS раствора в один резервуар с температурным уравновешенным слайдом канала.
Поместите желатин покрытием канал слайд на тонкий полистирол или пенополистирола пластины для предотвращения падения температуры слайда с одним миллилитров люэр шприц, чтобы добавить 100 микролитров из четырех раз 10 до пятого миллилитров HUVEC подвески в слайд для семян и культивировать HUVEC. Инкубировать канал слайд с HUVEC в течение 60 минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. После этого заполните каждый средний резервуар на обоих концах слайда канала 60 микролитров среды ЭКГМС.
Инкубировать еще один час при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Затем, чтобы настроить микрофлюидный насос, сначала подключите equilibrated перфузии набор для блока насоса, заполнить 13,6 миллилитров ECGMS среды и начать программное обеспечение управления насосом. В меню установки жидкостного блока выберите адекватный набор перфузии и тип камерного слайда с помощью прокрутки вниз по окнам.
Выберите 0.007 dyne второй квадратный сантиметр в программном обеспечении для средней вязкости. Вне инкубатора соедините стеклянную бутылку, наполненную сухими бусинками кремнезема, с трубами давления воздуха. Выберите параметры потока в программном меню, установите давление до 40 миллибар и промыть насосные трубки с жидкой средой, начав непрерывный средний поток.
Мы гарантируем плотное вложение клеток с помощью субвлиятельно выращенных HUVECs и дополнительно сосредоточиться на получении пузырьков воздуха из системы, а также с использованием независимого питания для насосной системы. Нажмите на соединения труб, чтобы удалить пузырьки воздуха и убедиться, что пузырьки воздуха не циркулируют в насосной системе. Для подключения слайда канала, остановить циркуляцию потока в программном обеспечении управления насосом и удерживать средний поток и перфузии трубки путем зажима труб вблизи соединения Luer.
Подключите слайд канала, избегая тем самым пузырьков воздуха. В программном обеспечении управления насосом передовые вкладке, использовать создатель цикла программного обеспечения инструмента для программы желаемого цикла стресса стрижки для выращивания потока. Программа уровня стресса стрижки для циркуляции потока и начать долгосрочную перфузию.
Начните с пяти дина на квадратный сантиметр, который соответствует скорости потока 5,44 миллилитров в минуту в течение 30 минут с последующим непрерывным потоком при стрессе стрижки 10 дине на квадратный сантиметр, что соответствует скорости потока 10,85 миллилитров в минуту. Управление сбалансированной прокачкой резервуара. Поместите жидкий блок с подключенным слайдом канала в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе.
Запустите управление программным обеспечением микроскопа и отрегулируйте основные настройки для микроскопического мониторинга флуоресценции, выбрав соответствующие настройки фильтра. Для микроскопической визуализации поместите жидкостный блок в 37 градусов по Цельсию нагревательной камеры. Поместите слайд канала на сцену довоенной микроскопа.
Контроли морфологии клеток и целостности слоя HUVEC до инъекции гистамина и бактерий в циркуляцию потока. Поддерживайте настройку потока. Индуцировать высвобождение VWF из эндотелиальных жизнеспособных органов Palade путем введения 136 микролитров 100 миллимолярный раствор гистамина фонда через инъекционный порт в ECGMS среды циркулирующих в перфузии трубки.
Для обнаружения иммунофлюоресценции многомерных струн VWF в циркулирующие 13,6 миллилитров среды ЭКГМС вводят 20 микрограммов конъюгированных антител VWF. Для количественной оценки пневмококкового крепления к струнам VWF, генерируемым на поверхностях клеток HUVEC, ввисьйте 1,35 раза от 10 до восьмого CFU на миллилитр RFP, выражая пневмококки в максимальном объеме одного миллилитра в среду ЭКГМС с помощью порта впрыска. Выберите цель погружения масла 63X для увеличения микроскопа и отрегулируйте настройки фильтра флуоресценции в программном обеспечении микроскопа к каналу RFP с фильтром обнаружения 540 нанометров для обнаружения RFP, выражаюго пневмококки.
Для количественной оценки бактериального крепления к строкам VWF создайте снимки стеков из не менее 30 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит приблизительно 10 морфологически нетронутых HUVEC, и подсчитайте количество пневмококков. Для оценки бактериальной привязанности после фиксации до иммунофлуоресцентного окрашивания, остановить поток, удалить 10 миллилитров среды ЭКГМС из резервуаров насоса, и добавить 10 миллилитров PBS дополнены 5%paraformaldehyde и продолжить в соответствии с рукописью. В этом протоколе основные экспериментальные шаги начинаются с предварительного культивирования первичных эндотелиальных клеток для субвлияния в колбы клеточной культуры.
Клетки затем посеяны в желатин покрытием слайд канала. Бактерии выращиваются на агарных пластинах с последующим культивированием в сложной жидкой среде и средней фазе журнала. Для микрофлюидной клеточной культуры слайд канала с эндотелиальными клетками соединен с перфузиоными трубками жидкого блока насосной системы и подвергается постоянному потоку для дифференциации клеток.
Поколение струн VWF было вызвано инъекцией гистамина при стрессе с разрывом 10 дина на квадратный сантиметр и микроскопически контролировалось с помощью обнаружения иммунофлюоресценции с использованием специфических антител VWF с маркировкой FITC. После инъекции красного белка флуоресценции, выражаюного бактерии в циркулирующую среду, вложение пневмококка в струны VWF было микроскопически визуализировано в режиме реального времени с помощью флуоресцентного излучения на 450 нанометров. После фиксации клеток с помощью PFA, дифференциальное окрашивание иммунофторесценции обеспечивает визуализацию бактериальной привязанности в определенных точках времени инфекции.
Наиболее важным шагом этой процедуры является обеспечение плотного крепления клеток на поверхности слайда путем корректировки физиологического уровня стресса стрижки и избежания экстремальных колебаний давления насоса. Помимо микроскопической визуализации, этот метод может быть применен для изучения фармакологического воздействия новых противоинфекционых, а также для анализа долгосрочных последствий сосудистых инфекционных процессов. Эта насосная система перфусирует бактериальные патогены давлением воздуха, чтобы предотвратить любую передачу через аэрозоли.
Рекомендуется соблюдать меры биобезопасности.
