O uso desse sistema de cultura celular endotelial permite a assimilação da situação no fluxo sanguíneo. E com essa situação, podemos analisar processos de infecção bacteriana também incluindo a identificação de vetores bacterianos e também de vetores celulares que estão envolvidos nesse processo. Essa técnica abre caminho para explorar o impacto das infecções bacterianas na integridade vascular, incluindo também o impacto sobre os mecanismos de morfogênese, nas respostas à inflamação e na regulação imunológica.
Esta técnica requer algum manuseio especial das células endoteliais e, portanto, uma descrição visual é melhor do que apenas uma explicação verbal. Este método fornece insights sobre várias outras áreas de pesquisa correlacionadas com sistemas vasculares perfumados, como diferenciação de células endoteliais, cicatrização de feridas, gênese tumoral e angiogênese. Um dos passos fundamentais é o cultivo de células padronizadas, bem como o manuseio preciso das células endoteliais primárias.
Esta técnica requer algum manuseio especial da cultura celular que não poderia ser claro apenas por explicação verbal. Para começar, trabalhe em um ambiente estéril usando um banco limpo. Use uma pipeta para injetar 100 microliters de uma solução PBS de gelatina suína filtrada 2% estéril em um único reservatório de um deslizamento de canal equilibrado de temperatura.
Coloque o slide do canal revestido de gelatina em uma fina placa de poliestireno ou isopor para evitar uma queda na temperatura do slide com uma seringa de um mililitro Luer para adicionar 100 microliters das quatro vezes 10 à quinta suspensão por mililitro HUVEC no slide para se semear e cultivar o HUVEC. Incubar o slide do canal com o HUVEC por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois disso, encha cada reservatório médio nas duas extremidades do deslizamento do canal com 60 microliters de meio ECGMS.
Incubar por mais uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, para ajustar a bomba microfluitária, primeiro conecte o conjunto de perfusão equilibrado à unidade da bomba, encha com 13,6 mililitros de meio ECGMS e inicie o software de controle da bomba. No menu da configuração da unidade fluida, selecione o conjunto de perfusão adequado e o tipo de deslizamento de câmara usando as janelas de rolagem para baixo.
Escolha 0,007 dyne segundo por centímetro quadrado no software para viscosidade média. Fora da incubadora, conecte uma garrafa de vidro cheia de contas de sílica secando à tubulação de pressão de ar. Selecione parâmetros de fluxo no menu de software, defina a pressão em 40 milibar e lave os tubos da bomba com o meio líquido, iniciando o fluxo médio contínuo.
Garantimos um acessório celular apertado usando HUVECs subconfluentes e também nos concentramos em tirar bolhas de ar do sistema, bem como usar fonte de alimentação independente para o sistema de bomba. Toque nas conexões de tubulação para remover bolhas de ar e certifique-se de que não há bolhas de ar circulando no sistema da bomba. Para conectar o slide do canal, pare a circulação de fluxo no software de controle da bomba e segure o fluxo médio e a tubulação de perfusão, fixando os tubos perto da conexão Luer.
Conecte o slide do canal evitando bolhas de ar. Na guia avançada do software de controle de bomba, use o criador do ciclo de ferramentas de software para programar os ciclos de estresse desejados para o cultivo de fluxo. Programe os níveis de estresse da cisalhamento para circulação de fluxo e inicie a perfusão a longo prazo.
Comece com cinco dyne por centímetro quadrado que corresponde a uma taxa de fluxo de 5,44 mililitros por minuto durante 30 minutos seguido de fluxo contínuo ao estresse de cisalhamento de 10 dyne por centímetro quadrado que corresponde a uma vazão de 10,85 mililitros por minuto. Controle o bombeamento equilibrado do reservatório. Coloque a unidade fluida com o deslizamento de canal conectado em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Inicie o controle do software do microscópio e ajuste as configurações de princípio para o monitoramento microscópico de fluorescência selecionando as configurações apropriadas do filtro. Para visualização microscópica, coloque a unidade fluida na câmara de aquecimento de 37 graus Celsius. Coloque o slide do canal no palco de um microscópio pré-armado.
Controle a morfologia celular e a integridade da camada HUVEC antes da injeção de histamina e bactérias para a circulação de fluxo. Mantenha a configuração de fluxo. Induzir a liberação de VWF de corpos de Palade viável endotelial injetando 136 microlitadores de uma solução de estoque de histamina de 100 milimolares através de uma porta de injeção no meio ECGMS circulando na tubulação de perfusão.
Para detecção de imunofluorescência de cordas VWF multimerizadas, injete 20 microgramas de um anticorpo conjugado FITC específico da VWF em um volume de 200 microliters de PBS nos 13,6 mililitros circulantes do meio ECGMS. Para quantificar o acessório pneumocócico às cordas VWF geradas nas superfícies celulares HUVEC, injete 1,35 vezes 10 vezes 10 para a oitava CFU por mililitro RFP expressando Pneumococci em um volume máximo de um mililitro no meio ECGMS usando a porta de injeção. Selecione um objetivo de imersão de óleo 63X para ampliação do microscópio e ajuste as configurações do filtro de fluorescência no software de microscópio para o canal RFP com um filtro de detecção de 540 nanômetros para detecção de Pneumococci expressa de RFP.
Para quantificação do apego bacteriano às cordas VWF, crie instantâneos de pilhas Z de pelo menos 30 visões de campo representativas cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intactos e conte a quantidade de Pneumococci. Para avaliar o apego bacteriano após a fixação antes da coloração imunofluorescente, pare o fluxo, remova 10 mililitros de meio ECGMS dos reservatórios da bomba e adicione 10 mililitros de PBS suplementados com 5% de paraformaldeído e prossiga de acordo com o manuscrito. Neste protocolo, as principais etapas experimentais começam com um pré-cultivo de células endoteliais primárias à subconfluência em frascos de cultura celular.
As células são então semeadas em um slide de canal revestido de gelatina. As bactérias são cultivadas em placas de ágar seguidas pelo cultivo em uma fase de registro líquido complexo médio e médio. Para a cultura celular microfluida, um slide de canal com células endoteliais é conectado aos tubos de perfusão de uma unidade fluida do sistema de bomba e submetido a fluxo constante para diferenciação celular.
A geração das cordas VWF foi induzida pela injeção de histamina a um estresse de 10 dyne segundo por centímetro quadrado e microscopicamente monitorada pela detecção de imunofluorescência usando anticorpos específicos VWF rotulados pelo FITC. Após a injeção de proteína de fluorescência vermelha expressando bactérias ao meio circulante, o apego pneumocócico às cordas VWF foi microscopicamente visualizado em tempo real pela emissão de fluorescência em 450 nanômetros. Após a fixação das células que utilizam PFA, a coloração diferencial da imunofluorescência proporciona a visualização do apego bacteriano em pontos específicos de tempo de infecção.
O passo mais importante deste procedimento é garantir um acessório de célula apertado na superfície do slide, ajustando os níveis de estresse fisiológico da tesoura e evitando flutuações extremas de pressão da bomba. Além da visualização microscópica, essa técnica pode ser aplicada para estudar efeitos farmacológicos de novos anti-infecciosos e também para analisar as consequências a longo prazo dos processos de infecção vascular. Este sistema de bomba perfusa patógenos bacterianos por pressão de ar para evitar qualquer transmissão via aerossóis.
Recomenda-se seguir as precauções de biossegurança.
