Поскольку бактерии настолько малы, люди часто забывают, что они трехмерные объекты. Наш протокол позволяет точно восстановительные формы как плоских, так и изогнутых клеток. Этот протокол требует лишь небольших изменений в стандартный микроскоп, и они легко доступны в сценариях MATLAB.
Перед началом эксперимента поместите две стопки каждой из трех 20 на 20 миллиметров крышки скользит на противоположных концах одного стеклянного микроскопа слайд. Pipette 200 микролитров раствора агарозы площадку на слайде и сразу же и твердо место второй слайд на стек крышки скользит, чтобы сгладить агарозу. После разрешения агарозы затвердеть в течение одной минуты при комнатной температуре тщательно соскользнуть верхней слайд и использовать большой конец 200 микролитер пипетки отзыв вырезать отдельные пять миллиметров диаметром колодки из геля.
Когда все колодки были получены пипетки E.coli клеточной культуры несколько раз, чтобы нарушить любые клеточные сгустки и обеспечить, чтобы клетки однородно распределены перед добавлением одного микролитер субкультуры на каждой площадке. После сдачи образцов воздух сухой в течение пяти до 10 минут подтверждают, что капли были полностью поглощены в колодки перед размещением крышку скольжения на колодки. Затем используйте ватный тампон, чтобы аккуратно почистить соответствующий герметик по краю крышки скольжения, заботясь, чтобы держать герметик от верхней части крышки скольжения.
Сразу же после уплотнения крышки скольжения место слайд на стадии микроскопа и после пяти минут тепловой эквилибрации использовать микроскоп фокус колеса довести середину клетки в центре внимания. В связанном программном обеспечении микроскопа в соответствии с ND Acquisition, проверьте коробку q, чтобы приобрести стек и нажмите кнопку Home, чтобы установить середину ячейки в качестве отправной точки. Установите размер шага до 0,1 микрометра и диапазон до четырех микрометров и убедитесь, что устройство q установлено на сцене Пьезо.
Очень важно, чтобы на верхней и нижней части клетки было достаточно размытия, так что клетка почти неотличима от фона. Установите флуоресцентные каналы под окном лямбды в настройки для флуоресцентных молекул, которые будут изображены и подтвердите, что порядок эксперимента установлен на lambda так, что полный стек q будет получен в каждом цветном канале перед переключением. Затем нажмите Run now, чтобы начать приобретение изображения.
Когда все изображения были приобретены открыть файлы в соответствующей программе анализа изображений. Нарисуйте коробку вокруг отдельной ячейки и дублируйте эту ячейку два раза, один раз для каждого канала, убедившись, что коробка с гиперстахом Duplicate проверена, и измените канал на один или два. После того, как оба стека доступны, выберите изображения, стеки, инструменты и Concatenate для объединения изображений.
С каналом протеина сперва и каналом формы вторым. После сохранения нового изображения в качестве файла TIFF сделайте папку внутри папки на рабочем столе, которая содержит обрезанные изображения и cell_shape_settings_tri. txt файл из ша-клеток-общественных exampleData_tri.
Отредактировать cell_shape_settings_tri. txt файл, чтобы иметь правильные настройки для эксперимента интереса. И запустите Cell_shape_detector3dConvTriFolder функцию со строкой в расположение папки, а затем количество ячейки, на которой начать и количество ячеек, которые должны быть запущены.
Чтобы подтвердить, что ячейки были должным образом реконструированы запустить ScreenFits. Когда графический пользовательский интерфейс открывается, нажмите кнопку Select Folder и выберите папку с файлами данных реконструкции, чтобы визуально экран отдельных реконструкций ячейки. Для любой ячейки, которая появляется деформированной или которая не имеет полного покрытия, выберите поле рядом с реконструкцией, чтобы прибвести FLAG к имени, чтобы она можно было исключить из любого анализа ниже по течению.
Вы запустите enrichmentSmothingSpline, чтобы создать профиль обогащения относительной концентрации белка интереса как функции гауссийской кривизны на поверхности. Затем выберите каждую папку с только что созданным TRI. мат файлы и выбрать вновь созданный файл кривой коврик.
Этот метод особенно полезен при работе с изогнутыми или аномально сформированными клетками, так как 2D-представление не может точно отражать кривизну клеток. В этом эксперименте зеленый флуоресцентный синтез белка бактериального белка актина MreB был создан для изучения точной локализации белка актина как в диком типе, так и в мутантных клетках E.coli. Делая эти измерения в 3D захваченных изображений формы как дикого типа и стержня мутантных клеток были в состоянии быть реконструированы.
Затем было установлено, что локализация MreB будет обогащена небольшими искривлением Гауссии, геометрической особенностью, которая может быть измерена только в 3D зависимой манере. Не забудьте убедиться, что стек q достаточно велик, чтобы клетки были размыты сверху и снизу и чтобы клетки хорошо отозрались друг от друга. Мы показываем, как измерить геометрическую локализацию белков в 3D, но другая информация может быть рассчитана из этих данных, таких как размер сборки белка тегов.
