Bakteriler çok küçük olduğu için, insanlar genellikle üç boyutlu nesneler olduklarını unuturlar. Protokolümüz hem düz hem de kavisli hücrelerin şekillerinin doğru şekilde yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Bu protokol yalnızca standart bir mikroskopta küçük değişiklikler gerektirir ve MATLAB komut dosyalarında kolayca kullanılabilir.
Denemeye başlamadan önce, tek bir cam mikroskop kaydırağının zıt uçlarına her üç 20'den 20'şer iki deste kapak yerleştirin. Pipet 200 mikrolitre agarose ped çözeltisi slayt üzerine ve hemen ve sıkıca kapak fişleri yığını üzerine agarose düzleştirmek için ikinci bir slayt yerleştirin. Agarose oda sıcaklığında yaklaşık bir dakika katılaşmak için izin sonra dikkatle üst slayt kapalı slayt slayt ve jel bireysel beş milimetre çapında pedleri kesmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu büyük bir ucu kullanın.
Tüm pedler pipet elde edildiğinde, herhangi bir hücre kümelerini bozmak ve her pedüzerine bir mikrolitre altkültür eklemeden önce hücrelerin homojen bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için E.coli hücre kültürü birkaç kez elde edilir. Numunelerin 5 ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyince damlacıkların pedlere bir kapak kayma koymadan önce yastıkların tamamen emildiğini doğrular. Daha sonra kapak fişinin kenarına uygun bir dolgu sıvısını nazikçe fırçalamak için pamuklu bir bez kullanın ve dolgu sıvısını kapak fişinin üst kısmından uzak tutmaya özen çekin.
Kapağı mühürledikten hemen sonra kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve beş dakikalık termal dengeden sonra bir hücrenin ortasını odak haline getirmek için mikroskop odak tekerleklerini kullanın. ND Acquisition altında ilişkili mikroskop yazılımında, Z yığını elde etmek için Z kutusunu işaretleyin ve hücrenin ortasını başlangıç noktası olarak ayarlamak için Ana Ekran düğmesini tıklatın. Adım boyutunu 0,1 mikrometreye, Menzili dört mikrometreye ayarlayın ve Z Aygıtının Piezo aşamasına ayarlandıklarına emin olun.
Hücrenin arka plandan neredeyse ayırt edilemez olması için hücrenin hem üst hem de alt kısmında yeterli bulanıklık olması önemlidir. Lambda penceresinin altındaki floresan kanalları, görüntülenecek floresan moleküllerin ayarlarına ayarlayın ve geçiş yapmadan önce her renk kanalında tam bir Z destesi elde edilebilmesi için deneme sırasının lambda olarak ayarlandığını doğrulayın. Ardından görüntü edinimi başlatmak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın.
Tüm görüntüler elde edildiğinde uygun bir görüntü analizi yazılım programında dosyaları açın. Tek bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve bu hücreyi her kanal için bir kez, Yinelenen hiper yığın kutusunun işaretli olduğundan emin olmak için iki kez çoğaltın ve kanalı bir veya iki hücreye değiştirin. Her iki yığın kullanılabilir hale getirinde, görüntüleri birleştirmek için Görüntüler, Yığınlar, Araçlar ve Concatenate'i seçin.
Protein kanalı ile ilk ve şekil kanal ikinci. TiFF dosyası olarak yeni görüntü kaydolduktan sonra kırpılmış görüntüleri ve cell_shape_settings_tri içeren masaüstünde bir klasör içinde bir klasör yapmak. shae-cellshape-public exampleData_tri txt dosyası.
cell_shape_settings_tri'ı edin. txt dosya ilgi deneme için doğru ayarlara sahip olmak. Ve dize ile Cell_shape_detector3dConvTriFolder işlevini klasör konumuna çalıştırın ve ardından başlatılacak hücre sayısı ve çalıştırılması gereken hücre sayısı.
Hücrelerin düzgün bir şekilde yeniden oluşturulduğunu doğrulamak için ScreenFits çalıştırın. Grafik kullanıcı arabirimi açıldığında Klasörü Seç düğmesini tıklatın ve hücre yeniden yapılandırmalarını görsel olarak görüntülemek için yeniden yapılandırma veri dosyalarının yer alan klasörünü seçin. Şekilsiz görünen veya tam kapsama alanına sahip olmayan herhangi bir hücre için, herhangi bir akış aşağı analizinin dışında tutulabilmesi için FLAG'ı ada eklemek için yeniden yapılanmanın yanındaki kutuyu seçin.
Yüzeydeki Gauss eğriliği fonksiyonu olarak ilgi proteingöreceli konsantrasyonu bir zenginleştirme profili oluşturmak için zenginleştirmeSmothingSpline çalıştırın. Ardından, yalnızca oluşturulmuş TRI ile her klasörü seçin. mat dosyaları ve yeni oluşturulan eğri mat dosyasını seçin.
Bu yöntem, 2B gösterimi olarak kavisli veya anormal şekilli hücreleri doğru bir şekilde yansıtamaz ken özellikle yararlıdır. Bu deneyde bakteriyel aktin proteini MreB'ye yeşil floresan füzyon proteini, hem yabani tipte hem de mutant E.coli hücrelerinde aktin proteininin kesin lokalizasyonunu incelemek için üretildi. Bu ölçümleri 3Boyutlu olarak yapılan görüntülerde hem vahşi tip hem de rodZ mutant hücrelerinin şekilleri yeniden yapılandırılabildi.
MreB'nin lokalizasyonunun, rodZ'ye bağlı olarak sadece 3Boyutlu olarak ölçülebilen geometrik bir özellik olan küçük Gauss eğriliklerinde zenginleştirilmeye karar verildi. Z yığınının, hücrelerin üst ve alt kısımda bulanıklaşacak ve hücrelerin birbirinden iyi aralıklı olduğundan emin olun. Proteinlerin 3Boyutlu geometrik lokalizasyonunun nasıl ölçüleceğini gösteriyoruz ancak etiket protein derlemelerinin büyüklüğü gibi diğer bilgiler bu verilerden hesaplanabilir.
