لأن البكتيريا صغيرة جدا، والناس غالبا ما ننسى أنها كائنات ثلاثية الأبعاد. بروتوكولنا يسمح بإعادة بناء دقيقة من الأشكال من كل من الخلايا المسطحة والمنحنية. يتطلب هذا البروتوكول تعديلات طفيفة فقط على المجهر القياسي وهي متوفرة بسهولة في نصوص MATLAB.
قبل البدء في التجربة مكان اثنين من أكوام من كل من ثلاثة 20 من 20 ملم غطاء زلات على طرفي نقيض من شريحة المجهر الزجاجي واحد. Pipette 200 microliters من حل وسادة agarose على الشريحة وعلى الفور وبحزم وضع شريحة ثانية على كومة من زلات الغطاء لتسطيح agarose. بعد السماح لأغاروز لترسيخ لمدة دقيقة واحدة تقريبا في درجة حرارة الغرفة الشريحة بعناية قبالة الشريحة العلوية واستخدام نهاية كبيرة من 200 دقيق ماصات تلميح لقطع منصات قطرها خمسة ملليمترات الفردية من هلام.
عندما تم الحصول على جميع منصات ماصة الخلية الإشريكية القولونية ثقافة عدة مرات لتعطيل أي كتل الخلية وضمان أن يتم توزيع الخلايا بشكل متجانس قبل إضافة ميكرولتر واحد من الثقافة الفرعية على كل لوحة. بعد السماح للعينات الهواء الجاف لمدة خمس إلى 10 دقائق تؤكد أن القطرات قد تم امتصاصها تماما في منصات قبل وضع زلة غطاء على منصات. ثم استخدام مسحة القطن لفرشاة بلطف تسرب المناسبة حول حافة زلة الغطاء، مع الحرص على إبقاء تسرب بعيدا عن الجزء العلوي من زلة الغطاء.
مباشرة بعد ختم زلة الغطاء وضع الشريحة على مرحلة المجهر وبعد خمس دقائق من التوازن الحراري استخدام عجلات التركيز المجهر لتحقيق منتصف خلية في التركيز. في برنامج المجهر المرتبط به ضمن اكتساب ND، تحقق من المربع Z للحصول على رصة Z وانقر فوق الزر الصفحة الرئيسية لتعيين منتصف الخلية كنقطة بداية. تعيين حجم الخطوة إلى 0.1 ميكرومتر والنطاق إلى أربعة ميكرومتر وتأكد من أن يتم تعيين الجهاز Z إلى مرحلة بيزو.
ومن الأهمية بمكان أن يكون هناك عدم وضوح كافية على كل من أعلى وأسفل الخلية بحيث تكون الخلية لا يمكن فصلها تقريبا عن الخلفية. تعيين القنوات الفلورية تحت نافذة لامدا إلى إعدادات لجزيئات الفلورسنت التي يتم تصويرها والتأكد من أن يتم تعيين ترتيب التجربة إلى لامدا بحيث سيتم الحصول على مكدس Z كامل في كل قناة لون قبل التبديل. ثم انقر فوق تشغيل الآن لبدء الحصول على الصورة.
عندما تم الحصول على جميع الصور فتح الملفات في برنامج تحليل الصور المناسبة. ارسم مربع حول خلية فردية و تكرار تلك الخلية مرتين، مرة لكل قناة، مع التأكد من تحديد مربع الكومة الفوقية المكررة، ثم قم بتغيير القناة إلى واحد أو اثنين. بمجرد توفر كل من التكديس، حدد الصور، والمكدسات، والأدوات، وسلسلة لدمج الصور.
مع البروتين قناة أولى والشكل قناة ثانية. بعد حفظ الصورة الجديدة كملف TIFF جعل مجلد داخل مجلد على سطح المكتب الذي يحتوي على الصور المقتصة cell_shape_settings_tri. ملف txt من exampleData_tri shae-cellshape-public.
قم بتحرير cell_shape_settings_tri. txt ملف أن يكون الإعدادات الصحيحة لتجربة الفائدة. وتشغيل وظيفة Cell_shape_detector3dConvTriFolder مع سلسلة إلى موقع المجلد متبوعاً بعدد الخلية التي سيتم تشغيلها وعدد الخلايا التي يجب تشغيلها.
للتأكد من أن الخلايا قد أعيد بناؤها بشكل صحيح تشغيل ScreenFits. عند فتح واجهة المستخدم الرسومية انقر فوق الزر تحديد مجلد وحدد المجلد مع إعادة إنشاء ملفات البيانات لشاشة بصرية عمليات إعادة إنشاء الخلايا الفردية. لأي خلية تظهر مشوهة أو التي تفتقر إلى تغطية كاملة حدد المربع الموجود بجوار إعادة البناء إلى ملحق FLAG إلى الاسم بحيث يمكن استبعاده من أي تحليل المتلقين للمعلومات.
تشغيل enrichmentSmothingSpline لإنشاء ملف تعريف إثراء من التركيز النسبي للبروتين الفائدة كدالة من انحناء الغاوسية على السطح. ثم حدد كل مجلد مع TRI التي تم إنشاؤها للتو. ملفات حصيرة وحدد ملف حصيرة منحنى تم إنشاؤه حديثا.
هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع الخلايا المنحنية أو على شكل غير طبيعي حيث لا يمكن أن يعكس التمثيل 2D انحناء الخلايا بدقة. في هذه التجربة تم توليد بروتين الانصهار الفلورسنت الأخضر إلى بروتين actin البكتيري MreB لدراسة التعريب الدقيق للبروتين أكتين في كل من النوع البري وخلايا القولونية المتحولة. من خلال إجراء هذه القياسات في صور 3D القبض على أشكال كل من نوع البرية وخلايا متحولة rodZ كانت قادرة على إعادة بنائها.
ثم تم تحديد توطين MreB بحيث يتم إثراؤه في انحناءات جاوسي الصغيرة ، وهي ميزة هندسية لا يمكن قياسها إلا في 3D بطريقة تعتمد على rodZ. تذكر للتأكد من أن مكدس Z كبير بما يكفي أن الخلايا غير واضحة في الأعلى والأسفل وأن الخلايا متباعدة بشكل جيد عن بعضها البعض. نحن نعرض كيفية قياس التعريب الهندسي للبروتينات في 3D ولكن يمكن حساب معلومات أخرى من هذه البيانات مثل حجم تجميعات بروتين العلامة.
