Como as bactérias são tão pequenas, as pessoas muitas vezes esquecem que são objetos tridimensionais. Nosso protocolo permite a reconstrução precisa das formas de células planas e curvas. Este protocolo requer apenas pequenas modificações em um microscópio padrão e eles estão prontamente disponíveis em scripts MATLAB.
Antes de começar, o experimento coloca duas pilhas de cada uma das três coberturas de 20 por 20 milímetros nas extremidades opostas de um único slide de microscópio de vidro. Pipeta 200 microliters de solução de almofada agarose sobre o slide e imediatamente e firmemente colocar um segundo slide sobre a pilha de deslizamentos de cobertura para achatar a agarose. Depois de permitir que a agarose se solidifique por cerca de um minuto à temperatura ambiente, deslize cuidadosamente para fora do slide superior e use uma grande extremidade de uma ponta de pipeta de 200 microliter para cortar almofadas individuais de cinco milímetros de diâmetro do gel.
Quando todas as almofadas foram obtidas pipeta a cultura celular E.coli várias vezes para interromper qualquer aglomerado celular e para garantir que as células sejam distribuídas de forma homogênea antes de adicionar um microliter de subcultura em cada almofada. Depois de deixar as amostras secarem o ar por cinco a 10 minutos, confirme que as gotículas foram completamente absorvidas nas almofadas antes de colocar uma tampa nas almofadas. Em seguida, use um cotonete para escovar suavemente um selante apropriado ao redor da borda do deslizamento da tampa, tomando o cuidado de manter o selante longe da parte superior do deslizamento da tampa.
Imediatamente após a vedação do deslizamento de cobertura coloque o slide em um estágio de microscópio e após cinco minutos de equilíbrio térmico use as rodas de foco do microscópio para colocar o meio de uma célula em foco. No software de microscópio associado sob ND Acquisition, verifique a caixa Z para adquirir uma pilha Z e clique no botão Home para definir o meio da célula como o ponto de partida. Defina o tamanho do passo para 0,1 micrômetros e o intervalo para quatro micrômetros e certifique-se de que o Dispositivo Z esteja definido para o estágio Piezo.
É fundamental que haja uma desfoca suficiente na parte superior e inferior da célula para que a célula seja quase indistinguível do fundo. Defina os canais fluorescentes sob a janela lambda para as configurações das moléculas fluorescentes que estão sendo imagens e confirme que a ordem do experimento é definida como lambda para que uma pilha Z completa seja obtida em cada canal de cores antes de mudar. Em seguida, clique em Executar agora para começar a aquisição da imagem.
Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas abram os arquivos em um programa de software de análise de imagem apropriado. Desenhe uma caixa em torno de uma célula individual e duplique essa célula duas vezes, uma vez para cada canal, certificando-se de que a caixa de hiperseco duplicada seja verificada e mude o canal para uma ou duas. Uma vez que ambas as pilhas estejam disponíveis, selecione Imagens, Pilhas, Ferramentas e Concatenato para combinar as imagens.
Com o canal de proteína em primeiro lugar e o canal de forma em segundo lugar. Depois de salvar a nova imagem como um arquivo TIFF faça uma pasta dentro de uma pasta na área de trabalho que contém as imagens cortadas e o cell_shape_settings_tri. arquivo txt de shae-cellshape-public exampleData_tri.
Editar o cell_shape_settings_tri. arquivo txt para ter as configurações corretas para o experimento de interesse. E execute a função Cell_shape_detector3dConvTriFolder com a sequência até o local da pasta, seguida pelo número da célula em que iniciar e o número de células que devem ser executadas.
Para confirmar se as células foram devidamente reconstruídas, execute o ScreenFits. Quando a interface gráfica do usuário for aberta, clique no botão Selecionar pasta e selecione a pasta com os arquivos de dados de reconstrução para analisar visualmente as reconstruções celulares individuais. Para qualquer célula que pareça disforme ou que não tenha cobertura completa, selecione a caixa ao lado da reconstrução para anexar FLAG ao nome para que possa ser excluída de qualquer análise a jusante.
Executar enriquecimentoSmothingSpline para criar um perfil de enriquecimento da concentração relativa da proteína de interesse em função da curvatura gaussiana na superfície. Em seguida, selecione cada pasta com o TRI criado. arquivos de tapete e selecione o arquivo de tapete de curva recém-criado.
Este método é especialmente útil ao lidar com células curvas ou de forma anormal como uma representação 2D não pode refletir a curvatura das células com precisão. Neste experimento, uma proteína de fusão fluorescente verde à proteína de actina bacteriana MreB foi gerada para estudar a localização precisa da proteína actina tanto no tipo selvagem quanto nas células mutantes de E.coli. Ao fazer essas medições em imagens capturadas em 3D, as formas tanto do tipo selvagem quanto das células mutantes rodZ foram capazes de serem reconstruídas.
A localização do MreB foi então determinada a ser enriquecida em pequenas curvaturas gaussianas, uma característica geométrica que só pode ser medida em 3D de forma dependente de rodZ. Lembre-se de ter certeza de que a pilha Z é grande o suficiente para que as células estejam borradas na parte superior e inferior e que as células estejam bem espaçadas umas das outras. Estamos mostrando como medir a localização geométrica de proteínas em 3D, mas outras informações podem ser calculadas a partir desses dados, como o tamanho dos conjuntos de proteínas de etiqueta.
