Основной целью этой рукописи является представление процедуры визуализации недавно разработанной фотонной микроскопии TIRF на основе чипов и микроскопии локализации одной молекулы, такой как dSTORM. Основным компонентом здесь является фотонический чип, которые сделаны из серии оптических волновых гидов. Свет внутри оптического волнового гида направлен на основе полного внутреннего отражения.
Часть света присутствует на поверхности в виде эвакуационых волн. Эти evanescent волны, они распадаются экспоненциально от поверхности, с глубиной проникновения в пару сотен нанометров. Это делает их пригодными для освещения TIRF.
Освещение TIRF с помощью оптического волнового гида доступно на очень большой площади, которая определяется геометрией волнового гида и, таким образом, идеально подходит для изображений с высокой пропускной способностью. Ключевое различие между традиционной установкой TIRF и dSTORM по сравнению с нашим подходом заключается в том, что мы используем фотонический чип для освещения образца, вместо того, чтобы посылать свет через объектив с целью визуализации. Наш подход отъединяет освещение и световую часть коллекции, открывая новые возможности визуализации.
Поместите чип в стеклянную чашку Петри с помощью вафельного пинцета и полностью накройте раствором 1%Hellmanex. Поместите чашку Петри на горячую плиту при 70 градусах в течение 10 минут. Пока все еще на hotplate, протрите поверхность с тампоном ткани cleanroom.
Удалите чип из чашки Петри. Промыть не менее 100 миллилитров деионеров воды. Промыть по крайней мере 100 миллилитров изопропанола, заботясь о том, чтобы растворитель не высыхает на поверхности, чтобы предотвратить испарение пятен.
Промыть не менее 100 миллилитров деионеров воды. Удар чип сухой с азотной пушкой. Приготовьте более поздние 150 микрометров PDMS, вращая его в чашке Петри.
Используйте скальпель, чтобы вырезать примерно 1,5 на 1,5 сантиметра кадра из слоя PDMS. Поднимите раму из чашки Петри пинцетом. Депозит его плашмя на чистый и полированный чип.
Образец теперь готов для посева клеток. После посева клеток удалите чип из мультимедиа. Используйте пипетку, чтобы удалить излишки жидкости из-за пределов камеры PDMS.
Удалите текущую жидкость из камеры PDMS с помощью пипетки, добавляя при этом около 60 микролитров чистого PBS одновременно. Заменить PBS с 60 микролитров чистой PBS, и пусть инкубировать в течение одной минуты. Повторите предыдущий шаг, позволяя ему инкубировать в течение пяти минут на этот раз.
Удалите PBS и замените его 60 микролитров раствора красителя. Оставьте образец инкубировать в течение 15 минут, защищая его от света. Вымойте образец с помощью PBS с помощью ранее описанной процедуры.
Удалите PBS и замените его 40 микролитров буфера изображения одновременно. Поместите крышку сверху, предотвращая образование пузырьков воздуха под ним. Аккуратно нажмите крышку на камеру визуализации, чтобы удалить излишки мультимедиа.
Используйте пипетки, чтобы удалить излишки мультимедиа за пределами крышки. Очистите область за пределами крышки с водой влажный тампон, чтобы избежать кристаллов, образованных сушеных остатков средств погружения. Эта версия установки состоит из трех основных компонентов.
Микроскоп с держатель фильтра, белый источник света, камера, и объективный револьвер. Этап соединения, который является трехосной стадией пьезо, с лазером, со волокном, и сотый объектив. Образец этап, который является одной оси ручной этап, с кончиком и наклоном, с вакуумным держателем.
Как соединение, так и этап выборки устанавливаются на двухосной моторизованной сцене для выборочных переводов. Поместите чип на вакуумный грузовик, с аспектом соединения к цели соединения. Убедитесь, что чип находится примерно на одном фокусном от цели соединения.
Включите вакуумный насос. Включите лазер до одного милливатта. Грубо отрегулируйте высоту чипа так, чтобы луч попал в его край.
Выключите лазер. Включите белый источник света. Выберите объектив с низким увеличением объектива, например, 10x.
Сосредоточьте микроскоп на волновой гиде. Переведить микроскоп вдоль волнового гида, чтобы увидеть, хорошо ли он выровнен с оптическим путем. Перемести микроскоп к краю соединения.
Включите лазер на один милливатт или меньше. Перевейте микроскоп вдоль края соединения, чтобы найти лазерный свет. Сосредоточьте луч на краю чипа.
Отрегулируйте этап соединения вдоль оптического пути в направлении, которое уменьшает размер пятна лазерного луча до тех пор, пока оно не исчезнет. Луч теперь находится выше или ниже поверхности чипа. Отрегулируйте высоту стадии соединения до тех пор, пока пятно луча не появится и не будет максимально.
Повторите два предыдущих шага, пока лазер не образует сфокусированное пятно. Перемести сфокусированное место в волновой гид, представляющий интерес. Перевестив микроскоп на небольшое расстояние от края так, чтобы сфокусированное пятно луча больше не было видно.
Выключите белый свет. Отрегулируйте контраст. Если волновой гид направляет, рассеянный свет вдоль волнового гида должен быть хорошо виден.
Отрегулируйте ось стадии соединения, чтобы максимизировать рассеянную интенсивность света. Выключите лазер. Включите белый свет.
При необходимости отрегулируйте контраст. Перейдите в область визуализации. Сосредоточьтесь на желаемой цели.
Выключите белый свет. Вставьте фильтр флуоресценции и поверните мощность лазера до одного милливатта. Установите время экспозиции камеры примерно до 100 миллисекунд.
Отрегулируйте контраст по мере необходимости. Убедитесь, что соединение по-прежнему оптимизировано. Найдите область, интересную для визуализации.
Включите этап пьезо, зацикленный на средних узлах. Захват по крайней мере 300 изображений. Загрузите захваченный стек изображений на Фиджи с помощью виртуального стека.
Из меню изображений на Фиджи выберите Stacks и Проект. Рассчитайте изображение TIRF, выбрав тип проекции, среднюю интенсивность. Включите лазер до одного милливатта и установите время экспозиции камеры до 30 миллисекунд.
Отрегулируйте контрастность и фокусировку. Увеличьте мощность лазера до тех пор, пока не будет наблюдаться мигание. Увеличьте масштаб небольшой области выборки.
Отрегулируйте контраст. Захват несколько изображений, чтобы увидеть, если мигает хорошо разделены. Отрегулируйте время экспозиции камеры для оптимального мигания.
Включите петель сцены пьезо. Запись стека изображения, по крайней мере 30000 кадров, в зависимости от плотности мигания. Откройте Фиджи и загрузите стек dSTORM в качестве виртуальных изображений.
При необходимости отрегулируйте контраст. Используйте прямоугольный инструмент, чтобы выбрать область, которую вы хотите реконструировать. Анализ Open Run в плагине ThunderSTORM на Фиджи.
Установите основные настройки камеры в ThunderSTORM, соответствующие вашему устройству. Остальные параметры по умолчанию, как правило, являются удовлетворительными. Начните реконструкцию.
Список локализации, предоставляемый программным обеспечением реконструкции, фильтруется для удаления неспецифических локализаций. При необходимости применяется дополнительная коррекция дрейфа. Основное различие между чип-изображения и традиционной визуализации в приборов и сбора данных.
Таким образом, качество реконструированных изображений можно оценить так же, как изображение из коммерческого микроскопа супер-разрешения. Поскольку используются многомодальные волновые моды, полученное изображение может, однако, проявлять неоднородное возбуждение, если собрано слишком мало изображений. Это показано на панели А.
Увеличение количества возбудимых моделей должно привести к неоднородной возбуждению, как показано на панели b. Здесь мы изображение печени синусоидальной эндотелиальной клетки, с флуоресцентно помечены плазменной мембраны. Панели a и b являются изображениями с ограниченной дифракцией.
Панель c показывает ограниченное дифракцией изображение вставки в панели b. Панель d показывает dSTORM изображение того же региона. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени имеют фенестрацию размером с нано в плазменной мембране, которые хорошо видны на изображении супер-разрешения в панели d.
Одним из главных преимуществ изображения на основе чипов на основе супер-разрешения является достижимое большое поле зрения. Панель показывает 500 микрон на 500 микрон-большой dSTORM изображение печени синусоидальных эндотелиальных клеток с флуоресцентно помечены микротубулин. Панель b показывает пурпурную вставку из панели A, с изображениями с ограниченным дифракцией и супер-разрешением для сравнения.
Панель c показывает зеленую вставку с панели a. Разрешение захваченного изображения составляет 77 нанометров. В этом видео, мы выполнили большое поле зрения TIRF и dSTORM изображения синусоидальных эндотелиальных клеток печени с помощью фотонной чип для освещения.
Наш метод менее сложен, компактнее и гибче обычного способа выполнения TIRF с помощью микроскопа с целью предопределенной численной диафрагмы и низкого поля зрения. Микроскопия локализации, такая как dSTORM, является одним из нескольких методов визуализации супер-разрешения, которые мы исследовали с помощью фотонной чипа. Например, свет может быть гораздо более плотно ограничен внутри высокорефракционного индекса оптического волнового материала, чем это возможно с помощью объектива, объективного изображения.
Это свойство чипового освещения нашло применение в увеличении разрешения метода оптической микроскопии на основе интенсивности и структурированной микроскопии освещения. Кроме того, фотонический чип также выигрывает от миниатюризации, эффективности затрат и простой оптической установки. Будучи интегрированной технологией делает его совместимым с другими оптическими функциями на чипе.
В целом, это позволяет переоборудовать в обычные микроскопы с ограниченной дифракцией, что позволяет супер-разрешение при низких затратах.
