本稿の主な目的は、新開発のフォトニックチップベースのTIRF顕微鏡とdSTORMなどの単分子局在顕微鏡のイメージング手順を提示することです。ここでの主なコンポーネントは、一連の光導波路で作られたフォトニックチップです。光導波路内部の光は、全内部反射に基づいて導かれます。
光の一部は、エバネッセント波の形で表面に存在しています。これらのエバネッセント波は、数百ナノメートルの浸透深さで、表面から指数関数的に崩壊します。これにより、TIRF照明に適しています。
光導波路を介したTIRF照明は、導波管の形状によって定義される非常に大きな領域で利用でき、したがって、高スループットイメージングに最適です。従来のTIRFとdSTORMの設定の主な違いは、イメージング対物レンズを通して光を送るのではなく、フォトニックチップを使用してサンプルを照らすことです。当社のアプローチは、照明とコレクションライト部分を分離し、新しいイメージングの可能性を開きます。
ウエハースのトゥイザーを使用してガラスペトリ皿にチップを入れ、1%Hellmanex溶液で完全にカバーします。ペトリ皿をホットプレートの上に70度置き、10分間置きます。ホットプレートに残っている間に、クリーンルームティッシュ綿棒で表面をこすります。
ペトリ皿からチップを取り外します。少なくとも100ミリリットルの脱イオン水ですすいでください。イソプロパノールの少なくとも100ミリリットルでリンスし、蒸発汚れを防ぐために溶媒が表面に乾燥しないように注意してください。
少なくとも100ミリリットルの脱イオン水ですすいでください。窒素銃でチップを乾かします。ペトリ皿で回転させることによって150マイクロメートルPDMSの後で準備します。
メスを使用して、PDMS層から約1.5センチメートルのフレームをカットします。ペトリ皿からフレームをチウエザーで持ち上げます。清潔で磨かれたチップに平らにしてください。
これで、サンプルはセルシードの準備が整いました。細胞のシード処理後、メディアからチップを取り出します。PDMSチャンバーの外側から余分な液体を除去するために、ピペットを使用してください。
約60マイクロリットルのクリーンPBSを同時に加えながら、ピペットでPDMSチャンバーの内部から現在の流体を取り除きます。PBSを60マイクロリットルのきれいなPBSに交換し、1分間インキュベートします。前のステップを繰り返し、今回は5分間インキュベートします。
PBSを取り出し、60マイクロリットルの染料溶液に交換します。サンプルを残して約15分間インキュベートし、光から保護します。前述の手順を使用して、PBSでサンプルを洗浄します。
PBSを取り出し、同時に40マイクロリットルのイメージングバッファに交換します。上にカバースリップを置き、下に気泡が形成されないようにします。カバースリップを撮像チャンバーにそっと押し付けて、余分な媒体を取り除きます。
パイプを使用して、カバースリップの外側の余分なメディアを取り除きます。乾燥した浸漬培地残基によって形成される結晶を避けるために、水湿った綿棒でカバースリップの外側の領域をきれいにします。このバージョンのセットアップは、3 つの主要コンポーネントで構成されています。
フィルターホルダー、白色光源、カメラ、および目的リボルバーを備えた顕微鏡。3軸ピエゾステージであるカップリングステージには、繊維結合レーザーとカップリングレンズが付いています。サンプルステージは、チップとチルトを備えた1軸マニュアルステージで、真空ホルダーが付いています。
カップリングとサンプルステージの両方が、サンプル変換用の2軸電動ステージに取り付けられています。カップリングファセットをカップリング目的に向けて、真空トラックにチップを置きます。チップがカップリング目的からおよそ1焦点距離離れているか確認してください。
真空ポンプをオンにします。レーザーを1ミリワットに切り上げる。大まかに、ビームがエッジに当たるようにチップの高さを調整します。
レーザーの電源を切ります。白色の光源をオンにします。低倍率の対物レンズ (例: 10x) を選択します。
顕微鏡を導波管に合わせます。導波管に沿って顕微鏡を移動して、光学路とよく一致しているかどうかを確認します。顕微鏡をカップリングエッジに移動します。
1 ミリワット以下でレーザーをオンにします。レーザー光を見つけるためにカップリングエッジに沿って顕微鏡を翻訳します。チップエッジにビームを焦点を合わせます。
光路に沿って、レーザー光スポットのサイズを小さくする方向にカップリングステージを調整します。ビームがチップ表面の上または下に表示されます。ビーム スポットが再び表示され、最大化されるまで、カップリング ステージの高さを調整します。
レーザーが焦点を合わせるまで、前の2つの手順を繰り返します。フォーカスしたスポットを目的の導波管に移動します。焦点を合わせるビームスポットが見えなくなるように、エッジから少し離れた距離に顕微鏡を移動します。
白色光を消します。コントラストを調整します。導波管が導いている場合は、導波路に沿って散乱した光がはっきりと見えるはずです。
散乱光強度を最大化するために、カップリングステージの軸を調整します。レーザーの電源を切ります。白色のライトを点灯します。
必要に応じてコントラストを調整します。イメージング領域に移動します。目的の想像の目的で焦点を当てます。
白色のライトを消します。蛍光フィルターを挿入し、レーザーパワーを1ミリワットに変えます。カメラの露出時間を約 100 ミリ秒に設定します。
必要に応じてコントラストを調整します。カップリングが最適化されていることを確認します。イメージングの対象領域を見つけます。
ピエゾステージループをオンにして、ノードを平均化します。300以上の画像をキャプチャします。仮想スタックを使用して、キャプチャしたイメージ スタックをフィジーに読み込みます。
フィジーのイメージメニューから、[スタック] と [Z プロジェクト] を選択します。投影タイプの平均強度を選択して、TIRF画像を計算します。レーザーを1ミリワットにして、カメラの露出時間を30ミリ秒に設定します。
コントラストとフォーカスを調整します。点滅が見られるまでレーザーパワーを上げます。サンプルの小さな領域を拡大表示します。
コントラストを調整します。いくつかの画像をキャプチャして、点滅が十分に分離されているかどうかを確認します。カメラの露出時間を調整して、最適な点滅を行います。
ピエゾステージループをオンにします。点滅密度に応じて、30,000 フレーム以上のイメージ スタックを記録します。フィジーを開き、仮想イメージとして dSTORM スタックを読み込みます。
必要に応じてコントラストを調整します。四角形ツールを使用して、再構築する領域を選択します。フィジーの ThunderSTORM プラグインで分析を開きます。
お使いのデバイスに対応するThunderSTORMで基本的なカメラ設定を設定します。残りのデフォルトパラメータは通常十分です。再構築を開始します。
再構築ソフトウェアによって提供されるローカリゼーションリストは、特定のローカリゼーションを除去するためにフィルタリングされます。必要に応じて、追加のドリフト補正が適用されます。チップベースのイメージングと従来のイメージングの主な違いは、計測とデータ収集にあります。
したがって、再構成された画像の品質は、市販の超解像顕微鏡からの画像と同様に評価することができる。マルチモードの導波ガイドが使用されるため、生成される画像は、収集される画像が少なすぎると不均一な励起を示す場合があります。これはパネル a に示されています。
励起パターンの量を増やすと、パネルbに示すように、不均一な励起が生じるはずです。ここでは、蛍光標識された形質膜を用いて、肝内皮細胞を画像化しました。パネルaおよびbは回折限定画像である。
パネルcはパネルbにインセットの回折限定画像を示す。パネルdは同じ領域のdSTORM画像を示す。肝正弦内皮細胞は、その細胞膜にナノサイズのフェネストレーションを有し、これはパネルdの超解像画像ではっきりと見える。
チップベースの超解像度イメージングの主な利点の1つは、達成可能な大きな視野です。パネルaは、500ミクロン、500ミクロン大きいdSTORM画像を示し、蛍光標識された微小管を有する肝臓の内皮細胞を示す。パネルbはパネルaからのマゼンタインセットを示し、回折制限画像と超解像度画像の両方を比較用に示している。
パネルcはパネルaからの緑色のインセットを示す。撮影した画像の解像度は77ナノメートルです。本ビデオでは、光子チップを照明用に使用して肝臓の内皮細胞のTIRFとdSTORMイメージングを大きな視野で行いました。
我々の方法は、所定の数値開口と低視野の顕微鏡目的を使用してTIRFを行う従来の方法よりも複雑で、よりコンパクトで、より柔軟です。dSTORMなどのローカリゼーション顕微鏡は、フォトニックチップを使用して探求してきたいくつかの超解像度イメージング技術の1つです。例えば、光は、撮像対レンズを使用する場合よりも、高屈折率の光導波路材料の内部にはるかにしっかりと閉じ込めることができます。
このチップ照明特性は、強度変動ベースの光学顕微鏡法および構造化照明顕微鏡の分解能を高める用途を発見した。さらに、フォトニックチップは、小型化、費用対効果、および簡単な光学セットアップの恩恵を受けます。統合された技術であることによって、他のオンチップの光学機能との互換性が生まれます。
全体として、これは従来の回折限顕微鏡への改造を可能にし、低い費用で超分解能を可能にする。
