Мы разработали инновационный метод метаболомики. Мы объединили спектральную визуализацию живых клеток Belfry с одноклеточной масс-спектрометрией. Наша техника может контролировать и прогнозировать метаболические изменения одиночных клеток против наркотиков.
И это открывает много приложений для фундаментальных исследований и промышленности. Наш метод добавляет одноклеточное разрешение к современным методам оценки наркотиков, которые будут в значительной степени помочь будущим усилиям по обнаружению наркотиков. Наша техника также может помочь нам понять роль, которую играет клеточная неоднородность в устойчивости к раку.
Одноклеточная выборка и анализ данных являются наиболее сложными аспектами в этом эксперименте. В настоящее время мы работаем над автоматизацией этих двух этапов, особенно части выборки. Мы рекомендуем вам практиковать одноклеточный выборки задолго до эксперимента, так как каждая установка микроманипулятора немного отличается, и вы должны взять время, чтобы ознакомиться с управлением.
После инкубации клеток для достижения 70%-ного слияния, культурные клетки, представляющие интерес в соответствующих культурных средств массовой информации, добавить пенициллин-стрептомицин, чтобы избежать загрязнения. После измерения плотности клеток на гемоцитометре, субкультурные клетки в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю сетку или кварцевые горки, используя ту же среду при плотности посева в 0,7 раза от 10 до шестого. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов.
На следующий день, клетки достигают слияния от 50 до 60%Вымойте клетки два раза с предварительно разогретый буфер PBS при 37 градусов по Цельсию. Разделите клетки на обработанные наркотиками и необработанные подгруппы в 35-миллиметровых культурных блюдах. Смешайте тамоксифен, растворенный в диметилфоксиде, с культурными средствами массовой информации, чтобы получить окончательный объем в два миллилитра и концентрацию тамоксифена в 10 микромолях.
Это группа, которая лечится от наркотиков. Смешайте соответствующий объем DMSO в среду в качестве контрольной группы для изучения последствий DMSO. Инкубировать обе группы в два миллилитров шипами средств массовой информации в течение 24 часов, чтобы достичь слияния от 70 до 80% До спектральных измерений, проверить пинхол и лазерное положение матч с помощью цели.
Чтобы откалибровать спектрофотометр перед каждым экспериментом, поместите этанол в стеклянную нижнюю тарелку, измерьте спектр при данной интенсивности лазера в течение одной секунды и свяжут пик с известными длинами волн. Затем установив микрокамеру на 5%углекислого газа и 37 градусов по Цельсию. Как только микроскоп система будет готова, удалить клетки из инкубатора и сразу же промыть клетки дважды с разогретой буфер PBS при 37 градусов по Цельсию.
Затем добавьте два миллилитров разогретого PBS или FluoroBrite DMEM. Добавьте 10 микролитров воды в объектив для погружения в воду. И деликатно поместите стеклянную нижнюю клеточное блюдо на сцену микроскопа.
Зафиксив систему отбора проб клеток на раман-микроскопе. Подключите 3D микроманипулятор к держателю стеклянных капилляров, который крепится к пустому шприцу для сосания образца. Установите микроскоп на высокое увеличение поля 40 раз, чтобы наблюдать кончик стеклянной капиллярной, и убедитесь, что он не сломан.
Управление положением стеклянной капиллярной с помощью микроманипулятора. Убедитесь, что кончик капилляров центрируется в поле зрения. Затем перемести капилляр на ось, чтобы дать разрешение на культурное блюдо позже.
Поместите образец блюда на сцене микроскопа, отрегулируйте увеличение и фокус, выберите целевую ячейку на сетке блюдо, и переместить его в центр зрения. Измерьте каждую ячейку, сосредоточив лазерную линию. 15-секундного времени экспозиции на клетку достаточно для получения поперечного сечения клетки с четким сигналом Рамана.
Гальвано-зеркало позволяет сканировать одну клетку или группу клеток в течение нескольких десятков минут. Затем осторожно опустите стеклянный капилляр с помощью микроманипулятора, пока кончик не придет в фокус. Под микроскопическим наблюдением коснитесь одной клетки цели кончиком капилляра.
Затем начните применять отрицательное давление, используя шприц, чтобы поймать клетку внутри кончика капилляров. Запись этой процедуры, взяв видео, чтобы проверить сроки и всасывается расположение ячейки точно. Перемести капилляр вверх по оси З.
Затем отсоедините капилляр от капиллярного держателя, используя типсы в рамках подготовки к масс-спектрометрии анализа. После настройки инструмента масс-спектрометрии и анализа средств массовой информации добавьте два микролитров растворителя ионизации в капилляр, содержащий клетку. Зафиксите капилляр к наноэлектроспрей-адаптеру, подключенному к подходящему масс-спектрометру, и запустите метод автоматического приобретения.
Сравнительный анализ среднего спектра каждого состояния, с и без лечения наркотиками, показано здесь. Средний спектр этих двух условий явно отличается на различных пиках. В частности, пики на 1000 процентов, что является признаком ароматических соединений, таких как фенилаланин и тирозин, показывают сильные различия.
На основе проекции на скрытую модель структуры были рассчитаны VIP-оценки, которые представляют важность длин волн в дискриминации экспериментальных условий. Важно отметить, что самые высокие пики VIP-профилей соответствовали раманские пики, для которых были замечены сильные различия между двумя лечениями. Это подтвердило специфические молекулярные различия между обработанными и необработанными клетками.
После положительной идентификации, относительное изобилие препарата и его метаболитов были измерены в каждой клетке и по сравнению с фоновыми пиками в необработанных клетках. Сильные изменения наблюдались в изобилии тамоксифена. И это явление было еще более выраженным в случае его метаболита 4-гидрокси-тамоксифен.
Исследователи могут быть заинтересованы в изучении связи между спектральными изображениями и метаболическими профилями клеток. Наше исследование также имеет промышленное применение, поскольку оно позволяет проводить локальный скрининг клеток для фармацевтического производства. Необходимо позаботиться при подготовке растворителя ионизации для измерения масс-спектрометра.
Его следует подготовить под дымовой капотом. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не коснуться источника иона масс-спектрометра инструмент, чтобы избежать удара током. Наконец, капилляры выборки, используемые на протяжении всего измерения, очень острые, так что обрабатывать их с осторожностью, чтобы избежать травм.
