Наше понимание морфогенеза глаза исходит из предыдущих исследований фиксированных тканей. Однако в этих исследованиях отсутствовала клеточная и тканевая динамика. Используя покадровую визуализацию, мы можем захватить весь этот процесс для визуализации и анализа.
Наш метод, который использует преимущества внешнего развития в оптической прозрачности эмбрионов рыбок данио, которые облегчают живую визуализацию, и использует лазерную сканирующую конфокальную микроскопию, которая легко доступна в большинстве исследовательских кампусов. Исследователи, не разоявивших этот метод, должны ожидать некоторых проб и ошибок, прежде чем получить пригодный для использования набор данных. Многие шаги, особенно инъекции и встраивание, должны пройти хорошо, чтобы добиться успеха, поэтому наберитесь терпения.
Как только рыбки данио начнут размножаться, ожидая от 15 до 20 минут, чтобы убедиться, что яйца оплодотворяются, используйте пипетку P10 и микролитровые наконечники P10 для обратной загрузки вытянутой стеклянной капиллярной микроинъекционной иглы с 2,5-5 микролитрами интересующего разведения РНК. Когда яйцеклетки будут готовы, используйте переносную пипетку и рассекающий микроскоп, чтобы осторожно загрузить яйца в форму для инъекций, используя щипцы, чтобы свернуть эмбрионы так, чтобы одна клетка была видна по мере необходимости. Затем вводят все эмбрионы на одноклеточной стадии, нацеливаясь на клетку, а не на желток, чтобы обеспечить равномерную маркировку развивающегося эмбриона.
Примерно через 11 часов после оплодотворения поместите от одного до пяти миллилитров аликвоты 1,6% низкой расплавленной агарозы в среду E3 в тепловой блок с температурой 42 градуса Цельсия и используйте флуоресцентный микроскоп для скрининга успешно введенных эмбрионов с общей яркостью цветопередачи. Подсчитайте сомитов, чтобы правильно завести эмбрионы. Через 11 часов после оплодотворения следует соблюдать три сомита.
Идеальный образец будет иметь сильные сигналы EGFP и mCherry и находиться на правильной стадии развития. Перед установкой поместите эмбрионы в блюдо, покрытое агаром, и используйте щипцы, чтобы удалить хорион из каждого эмбриона. Когда все эмбрионы будут обнажены, используйте стеклянную роликовую пипетку, чтобы аспирировать один эмбрион.
Выбросьте как можно больше Е3, чтобы эмбрион сидел на кончике стеклянной пипетки Пастера и уроните эмбрион в трубку агарозы из теплового блока. Позвольте эмбрионам погрузиться в агарозу на несколько секунд, прежде чем аспирировать небольшой объем агарозы вместе с эмбрионом, заботясь о том, чтобы эмбрион оставался на кончике пипетки. Выталкнуть эмбрион и агарозу в каплю агарозы в стеклянной нижней посуде и быстро, но осторожно использовать щипцы, чтобы сориентировать эмбрион дорсальной стороной вниз, прежде чем капля агарозы затвердеет.
После установки от 10 до 12 эмбрионов таким же образом добавьте достаточно агарозы, чтобы полностью покрыть дно блюда, закрепив все капли в одном агарозном диске. Когда агароза затвердеет, слой E3 поверх агарозы, чтобы сохранить образцы гидратированными. После установки лазерного сканирующего конфокального микроскопа на соответствующие параметры для покадровой визуализации обильно покрывайте нижнюю сторону стеклянной нижней чашки иммерсионной средой, соответствующей показателю преломления воды, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха, и нанесите небольшую каплю погружной среды на объект 40X воды.
Закрепите стеклянную нижнюю посуду в сценической вставке и добавьте дополнительную среду E3, чтобы сохранить эмбрионы влажными в течение ночи. Используйте пластилину для моделирования, чтобы запечатать пластиковую крышку над тарелкой и поднять цель, чтобы установить контакт с блюдом. Под заголовком позиций программного обеспечения микроскопа нажмите кнопку Добавить, чтобы сохранить информацию XYZ о первом образце, который будет замедлен, и выберите образец с сильной флуоресценцией и оптимальным монтажом.
На вкладке Поиск найдите следующий образец, щелкните Позицию и добавить, чтобы выбрать образец, как показано на примере. Когда все образцы будут выбраны, выделите первую позицию и нажмите кнопку «Переместить в». При непрерывном сканировании выровняйте зрительный везикул в кадре, оставляя достаточно места в передней и дистальной областях относительно зрительного везикулы и мозга.
Чтобы назначить первый и последний Z-срезы, выберите установить первый и установить последний при движении по Z-направлению с помощью тонкой ручки фокусировки, сохраняя общее количество срезов около 63, чтобы приспособиться к росту оптической чашки. Включите дополнительное пространство на вентральной стороне зрительного везикла, чтобы обеспечить пространство для роста. После установки первого и последнего Z-срезов щелкните C, чтобы переместиться в центр Z-стека и настроить мощность и усиление лазера для обоих лазеров.
Когда мощность и усиление лазера будут установлены, остановите сканирование и нажмите кнопку Обновить, чтобы обновить информацию о положении. Чтобы перейти на следующую позицию, щелкните позицию две. После того, как первый и последний Z-срезы определены как продемонстрированные, откройте заголовок временных рядов и установите число циклов равным 300, а временной интервал равным 2,5 минутам.
Просмотрев настройки, чтобы убедиться, что все завершено, нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать таймлапс и убедиться, что первый раунд изображения записан правильно, прежде чем разрешить покадровую съемку работать в течение ночи. Прямое введение в одну клетку необходимо для равномерной маркировки и надежной флуоресценции. При погружении в агарозу эмбрионы должны быть равномерно расставляемы по всему блюду.
Если эмбрионы поставлены правильно, достаточно флуоресцентны и адекватно смонтированы, они останутся в кадре визуализации в течение покадровой съемки, что позволит визуализировать весь орган. Образцы, которые не ориентированы вдоль дорсальной оси, например, горизонтальные или диагональные, будут вырастать из кадра визуализации по мере прохождения таймлапса и не могут быть использованы для дальнейшего анализа. Эмбрион, который чрезмерно вращается, приведет к более заднему замедлению.
Эмбрион, который недостаточно вращается, позволит наблюдать только самую передовую ткань. Кроме того, образцы, которые монтируются относительно ориентации рамы, с большей вероятностью дают успешную временную съемку. Этот уклон в сторону вентральной стороны обеспечивает дополнительное пространство для роста тканей в вентральном направлении, что приводит к оптимальной покадровой съемке.
Когда эти критерии не выполняются, покадровая съемка больше не будет захватывать весь 3D-объем ткани по мере ее развития и не может быть использована для дальнейшего анализа. Эти богатые информацией наборы данных могут быть проанализированы многими способами, включая 4D-отслеживание клеток с количественными показателями скорости и траектории клеток, измерения объема клеток и тканей, а также 3- и 4D-визуализации.
