Внеклеточное поле пузырьков не имеет генетически уровертной беспозвоночных модели для изучения белковых и РНК-сигналов внеклеточных пузырьков. Этот протокол устанавливает методы для получения обильных, чистых внеклеточных пузырьков от C.elegans. Этого достаточно для надежного РНК-СЭЗ и протеомного анализа.
Когда синхронизированная культура C.elegans исчерпали пищу от их нормального роста средней пластины, использовать резинки для обеспечения пятиметровой нейлоновой сетки фильтр крышка на стерильную бутылку и начать вакуум. Налейте червей L1 на фильтр и передать равный объем среды над червя агрегатов. После вихря перенесите три 10 микролитровых тома подвески червя на крышку пластины выращивания червей и подсчитайте количество животных в каждой капле.
Отрегулируйте подвеску червя до двух животных на микролитер свежей среды и снова вихрем подвески. Затем добавьте девять, 10 капель микролитров червей на новую крышку пластины и вручную подсчитайте количество животных в каждой капле. Затем вычислите среднее и стандартное погрешность среднего в процентах от каждой популяции червей и вычислите общее количество животных в каждой популяции.
Чтобы подготовить червей для генерации секретом, мыть червей с тремя пять минут моет в 15 миллилитров стерильных M9 среды с 50 микрограммов на миллилитр карбенициллина на тарелку на стирку с нежным закрученного выбить червей, объединение моет в 50 миллилитров конической трубки. После последней стирки разбавьте червей до одного животного на микролитр раствора S-Basel, дополненного 2,5 микрограммами на миллилитр холестерина и 50 микромолярной концентрацией карбенициллина. Затем добавьте до 400 миллилитров подвески червя в стерильную двухлитровую нижнюю сбитую с толку колбу.
Поместите колбу на круговой ротатор при 20 градусах Цельсия и 100 вращениях в минуту в течение 24 часов. Для экстраклеточного сбора пузырьков, передача червей в 50 миллилитров конической трубки для центрифугации и декантировать супернатант через 0,22 микрометровый вакуумный фильтр для удаления любых твердых частиц мусора. После подсчета, поместите каплю подвесных червей на бактериальный газон и оценка животных, как движущиеся, парализованные, или мертвые через 15 минут.
Затем сконцентрировать фильтрованный супернатант до 700 микролитров с регенерируемой нитроцеллюлозой 10 килодалтонный молекулярный фильтр отсечения веса и добавить 150 микролитров свежего раствора S-Basel для сокращения. Фильтр и вихрь в результате решения и повторить сокращение и фильтрацию еще в два раза, как только что продемонстрировали. После последней фильтрации, центрифуга супернатант для удаления любых частиц и мусора, которые, возможно, накопились во время обработки и добавить ингибитор протеазы коктейль плюс EDTA в соответствии с инструкциями производителя.
Чтобы подготовить столбец исключения размера, декант 15 миллилитров подвесной смолы агарозы в пустой картридж колонки гравитационного потока. Когда столбец осушется, добавьте раствор S-Basel до тех пор, пока смоляная кровать не будет упакована при окончательном объеме в 10 миллилитров. Замените буфер смолы 40 миллилитров стерильного фильтрованного раствора S-Basel, заботясь о том, чтобы не беспокоить смолу, и дайте гравитации слить буфер через колонну.
После того, как верхняя часть смолы больше не погружается, крышка нижней части картриджа, чтобы остановить поток и место сбора трубки под колонкой. Чтобы инициировать фракциацию секретома, снимите крышку и сразу же добавьте концентрированный секретом раствор дроп-мудрый в верхней части колонны кровать, а затем добавление одного миллилитра S-Basel решение падение мудрым. Поместите под колонку свежую коллекторную трубку и медленно заполните верхний столб резервуар пятью миллилитров раствора S-Basel.
После сбора первых двух миллилитров элуата, быстро изменить трубки, чтобы собрать следующие четыре миллилитров. Используйте регенерированную нитроцеллюлозу 10 килодальтонового молекулярного фильтра для отсечения спинового фильтра, чтобы сконцентрировать внеклеточное везикулу, содержащую колонку, до 300 микролитров и перенести ретентат фильтра в низкообязательное микроцентрифугное трубку. Затем промыть фильтровальную мембрану два раза с помощью 100 микролитров раствора S-Basel при 20 секундах вихря на стирку и объединить промывки с оригинальным ретентатом для окончательного объема образца в 500 микролитров.
Для подготовки внеклеточных пузырьков для количественной оценки с помощью цитометрического анализа потока добавьте 840 микролитров раствора S-Basel и 60 микролитров очищенных внеклеточных пузырьков в микроцентрифугную трубку. Добавьте 300 микролитров образца в две дополнительные микроцентрифуговые трубки вместе с семью микролитров соответствующего потентиометрического зонда на трубку. Добавьте семь микролитров 1%Triton X-100 в последнюю трубку и смешайте все трубки вихрем.
Поместите наконечник sonicator в центре трубки третьего образца и пульс образца 10 раз на 20% мощности и 30% цикла службы. Далее добавьте 300 микролитров раствора S-Basel в две контрольные микроцентрифуговые трубки и добавьте семь микролитров зонда в единственную трубку красителя. Этикетка второй трубки буфера только.
Затем инкубировать все трубки в течение одного часа при комнатной температуре защищены от света до их анализа поток цитометрии в соответствии со стандартными протоколами. Для анализа данных откройте файлы в соответствующем программном обеспечении цитометрического анализа потока. Установите прямоугольные ворота, начиная с верхней части участка, охватывающего от небольшого угла света рассеяния уровне в один раз от 10 до двух до одного раза 10 до четырех и чего ворота вниз, пока он не содержит около 2,5% от общего числа событий.
Назовите ворота после зонда и скопировать и вставить ворота на два других образца и контролировать участки данных. Затем экспорт анализа в электронную таблицу. Здесь показаны репрезентативные результаты 10 биологических репликаций.
Вариативность между репликациями не является значительным и типичная стандартная погрешность среднего размера популяции составляет чуть более 10%Передача животных между пластинами приводит к примерно 10%потере животных, в то время как около 20% животных теряются в этапе флотации сахарозы. В среднем, 1000 молодых взрослых животных дикого типа будут выделяет один микрограмм белков размером более 10 килодалтонов в окружающую среду. Когда эта фракция дополнительно отделяется от размера исключение хроматографии, общий профиль элюции белка демонстрирует небольшой пик белка между двумя-шестью миллилитров и большой пик после восьми миллилитров.
Внеклеточные пузырьки содержатся в первых пяти миллилитров колонки eluate. В прямом сравнении характеристик цитометрии потока между C.elegans и человеческими внеклеточными пузырьками, гистограмма внеклеточных событий образца пузырьков C.elegans, отсортированная по небольшому рассеянию углового света, показывает, что все препараты пик при среднем интенсивности флуоресценции примерно один раз от 10 до трети. Потенциметрический зонд DI-8-ANEPPS, надежно маркирует внеклеточные пузырьки C.elegans и обилие очищенных внеклеточных пузырьков, отсортированных по выражению DI-8-ANEPPS, не сильно отличается между C.elegans и клеточной культурой производных препаратов.
Образцы, подготовленные этой процедурой, подлефтяются для всех типичных методов внеклеточного анализа пузырьков ниже по течению, включая РНК-СЭЗ, цитометрию потока, анализ слежения за наночастицами и протеомный анализ. Создание методов очистки внеклеточных пузырьков C.elegans позволяет исследователям использовать эту простую беспозвоночные модели для изучения генетических путей и физиологических процессов, которые влияют на внеклеточный состав груза везикулы.
