Этот протокол обеспечивает строгую и воспроизводимую технику для извлечения и изоляции небольших внеклеточных пузырьков из образцов целых тканей для анализа экс-виво ниже по течению. С одним из самых высоких уровней чистоты в настоящее время достижимы, этот метод облегчает прямой морфологический, иммунофенотипический, и глубокая характеристика интерстициальных пузырьков выделяется в различных образцах тканей, в том числе опухолей. Здесь мы демонстрируем изоляцию тканей EVs от образцов опухоли мозга и легких.
Тем не менее, этот метод может быть применен к исследованиям с использованием различных, доброкачественных или других образцов опухоли, а также. Для начала приготовьте 10 миллилитров буфера диссоциации в среде Hibernate-E на каждые 0,4-1,0 грамма ткани. Добавить целые свежие или замороженные ткани в буфер в 50 миллилитров трубки, и инкубировать в теплой водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
После этого добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы для окончательной концентрации 1x в буфере диссоциации. Налейте раствор с тканью в свободные подходят падения гомогенизатора. Используйте приблизительно 30 медленных ударов на образец, чтобы мягко разобщить ткани.
Затем перенесите диссоциированную ткань и буферный раствор в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга на 500x g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки и оставшиеся волокна или сплоченные фрагменты тканей. Перенесите супернатант в чистую 50-миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 2000 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать и выбросить большой клеточный мусор.
Перенесите этот супернатант в чистую коническую трубку 50 миллилитров и центрифугу при 10 000 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 40 минут, чтобы гранулировать любые нежелательные большие пузырьки или маленькие апоптотические тела. Декант супернатант через 0,45 микрометровый фильтр в чистую 12 миллилитровую ультрацентрифугированную трубку. Далее, ультрацентрифуг образца на 100,000x g и при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы гранулировать небольшие EVs.
Декант supernatant и оставить ультрацентрифугации трубки перевернутый в течение пяти до 10 минут, нажав часто, чтобы удалить остатки жидкости по бокам труб. Затем, повторное производство гранул EV в 1,5 миллилитров 0,25 молярной сахарозы буфера. Обложка труб с Parafilm, а затем вихрь EVs в раствор.
Рок ультрацентрифуг трубки в течение 10 до 15 минут при комнатной температуре. А потом вихрь еще раз. Кратко центрифуга труб со скоростью менее 1000x г, чтобы восстановить жидкую подвеску в нижней части трубки.
При необходимости храните подвеску при четырех градусах по Цельсию на ночь. Во-первых, добавить 1,5 миллилитров 60%йодиксанола к 1,5 миллилитров буфера сахарозы tris, который содержит EVs для создания окончательного решения, содержащего 30%iodixanol. Pipette вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать раствор тщательно.
Перенесите этот раствор на дно 5,5 миллилитров ультрацентрифугации трубки. Далее, смешать 60%iodixanol запас с ультра чистой водой, чтобы подготовить по крайней мере 1,5 миллилитров как 20%и 10%iodixanol раствор. Используя шприц и 18 калибровочных игл, измерьте 1,3 миллилитров раствора 20%йодиксанола и тщательно наслоьте его поверх нижнего градиента.
Держите скошень иглы в контакте с внутренней частью трубки, чуть выше мениска и добавить раствор падение мудрым, чтобы избежать смешивания слоев на интерфейс плотности. Затем слой 1.2 миллилитров 10%iodixanol раствора на вершине 20%слой, используя ту же технику. Тщательно баланс и загрузить ультрацентрифугации труб в ротор ведра.
Установите скорость ускорения и замедления ротора ведра качели до минимальных ставок, и центрифуги на 268,000x g и при четырех градусах по Цельсию в течение 50 минут. В то время как образец в настоящее время центрифугирован, этикетка 10 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки для каждого образца, который будет соответствовать фракций от одного до 10 градиента плотности. Как только центрифуга будет завершена, аккуратно снимите трубки с ведер ротора и поместите их в стабильный держатель.
Pipette 10 серийных фракций из 490 микролитров из верхней части градиента в соответствующие трубки. Используя рефрактометр, измеряйте рефракционные индексы фракций. Затем перенесите каждую фракцию в чистую 12-миллилитровую ультрацентрифугированную трубку.
Добавить пять миллилитров 1x PBS к каждой трубке и пипетки вверх и вниз медленно смешивать. Добавить еще шесть миллилитров 1x PBS в верхней части трубки, и тщательно перемешать еще раз. Ультрацентрифуг трубки на 100 000x г и при четырех градусах по Цельсию, чтобы повторно гранулировать небольшие пузырьки.
Декант supernatant и нажмите трубки сухой перед лизикулы для анализа белка или reresuspending EVs для морфологического анализа. Чтобы подлизать EVs для анализа белка, добавьте 40 микролитров сильного буфера лиза, содержащего ингибитор протеазы, к гранулам EV. Поместите Parafilm над каждой трубкой, и вихрь энергично.
Далее, рок трубки в течение 20 минут при комнатной температуре и вихрь снова. Кратко центрифуга образца на 1000x г в течение 30 до 60 секунд, чтобы восстановить весь объем образца. Перенесите каждый образец в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 миллилитра и храните ее при температуре от 20 до 80 градусов по Цельсию до готовности к дальнейшей обработке.
Чтобы подготовить очищенные лизаты для иммуноблотного анализа, добавьте 5x буфер образца Laemmli к образцам для окончательной концентрации 1x. Отварить образец при 95 градусах по Цельсию в течение пяти-десяти минут. Затем загрузите равный объем фракций от одного до 10 в 10%SDS страницу геля.
Загрузите равную массу гомогената тканей. Выполните электрофорез и западный анализ помарки, чтобы подтвердить белки EV в очищенных лизатах и сравнить относительное изобилие EV в фракциях. В этом исследовании, внеклеточные пузырьки извлекаются и очищаются от целых тканей.
После ультрацентрифугации градиента от 10 до 30%йодиксанола можно увидеть популяцию легких ЭВ, мигрирующих до второй фракции, в то время как популяция плотных ЭВ может быть замечена мигрирующей до пяти фракций, в зависимости от типа ткани. Представительные иммуноблотации градиентных фракций демонстрируют эффективное разделение и очищение мелкой опухоли, полученной ЭВ во фракции 5. Примечательно, что образцы опухоли легких, как представляется, обогащены в плотных EVs по сравнению со светом EVs, которые ранее были собраны из всей ткани мозга.
Репрезентативный анализ слежения за наночастицами и электронная микроскопия тканевых пузырьков в преобладающей везикуле, содержащей фракцию, демонстрируют обогащение и сохранение целых пузырьков. В соответствии с известным размером и структурой малых EVs. Интерстициальные EVs представляют собой перспективные цели для разработки новых диагностических или прогностических анализов биомаркеров.
Этот метод предоставляет исследователям инструменты для извлечения и очистки пузырьков для вниз по течению полезности. После извлечения целых или лизированная ткань EVs, широкая характеристика пузырьков, включая протеомные, геномные и липидомные анализы могут быть выполнены. Кроме того, образцы могут использоваться для более целенаправленных подходов.
Vesicles изолированы непосредственно от образцов тканей может обеспечить дальнейшее понимание механизмов заболевания, в том числе генезиса опухоли, и может обеспечить важные диагностические или прогностические инструменты в будущем.
