Этот протокол представляет собой модель для исследования гемосовместимости устройств, контактных с кровью, в соответствии с руководящими принципами Международной стандартной организации. Модель идеально подходит для имитации физиологических условий, которые соответствуют имплантату, так как низкий фон для тромботических явлений и низкая концентрация антикоагулянтов позволяют провести широкий анализ параметра крови. Этот метод идеально подходит для исследования биоматериала, поскольку он обеспечивает простой способ оценки гемосовместимости.
Кроме того, он может быть использован для доклинкологических исследований. Для загрузки гепарина, первая смесь 5000 международных единиц неразбавленного гепарина с 0,9% хлорида натрия, чтобы получить 15 международных единиц на миллилитр концентрации гепарина. Затем добавьте 900 микролитров разбавленного раствора гепарина в три нейтральных моноветта и три зарезервированных моноветта на одного донора и храните моноветы, загруженные гепарином, при четырех градусах Цельсия.
За 30 минут до сбора образцов крови поместите моноветы при комнатной температуре. Когда моноветы прогрелись, собрать девять миллилитров крови в каждый из трех моноветов на одного донора, прежде чем объединить все 27 миллилитров крови от каждого донора в один пластиковый контейнер. Чтобы подготовить петлю потока, загрузите по крайней мере одну трубку на состояние с нейрососудистым лазерным имплантатом, представляющим интерес, и поместите один конец каждой трубки в резервуар, наполненный хлоридом натрия 0,9%.
Поместите выгруженную трубку в резервуар и соедините все трубки с головой насоса. Затем вставьте другой конец каждой трубки в измерительный цилиндр и отрегулируйте настройки перистальтического насоса до скорости потока 150 миллилитров в минуту с помощью таймера при проверке уровня заполнения в измерительном цилиндре. Для тестирования на гемосовместимость используйте 12 миллилитровый шприц, чтобы заполнить каждую трубку шестью миллилитров крови.
После формирования цепи, используйте 0,5 сантиметра длиной силикона подключения трубки, чтобы закрыть трубы плотно и поместить трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем запустите 60-минутную трубку. Для анализа всего анализа крови добавьте 1,2 миллилитров непротесненной крови или 1,2 миллилитров крови из каждой трубки после перфузии в отдельные моноветы, содержащие ЭДТА.
Тщательно инвертировать моноветы пять раз и загрузить флаконы в анализатор крови для анализа крови каждого образца. В конце анализа поместите моноветы на лед на 15-60 минут. Для сбора цитратной плазмы заполните цитратсодержащие моноветты 1,4 миллилитров непроверенной или пролитой крови и тщательно инвертировать каждый моноветт пять раз.
Разделив плазму центрифугой и перенесите три 250 микролитровых алицитов плазменной фракции в отдельные 1,5 миллилитровые реакционные трубки. Затем заморозить образцы плазмы в жидком азоте и хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию до их анализа. Для сбора плазмы ЭДТА, после четырех градусов по Цельсию инкубации после измерения количества крови, отделить плазму центрифугации и передачи трех 250 микролитр aliquots плазменной фракции в отдельных 1,5 миллилитров реакции труб.
Затем заморозить образцы плазмы в жидком азоте для хранения минус 20 градусов по Цельсию. Для сбора плазмы CTAD заполните CTAD-содержащие моноветы 2,7 миллилитров свеженатянутой или пролитой крови и тщательно инвертировать трубки пять раз. Поместите моноветы на лед в течение 15-60 минут, прежде чем собирать плазму центрифугации.
Передача 700 микролитров каждой средней плазменной фракции в отдельные 1,5 миллилитров реакционные трубки и центрифуга заполненные реакционные трубки снова. Затем перенесите две 100 микролитровых алицитов средней фракции в отдельные 1,5 миллилитровые реакционной трубки и заморозьте трубки в жидком азоте для их хранения при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для измерения уровней TAT в образцах цитратной плазмы добавьте 50 микролитров буфера образца ELISA в каждую скважину из 96-хорошо ровной нижней пластины и 50 микролитров плазменного стандарта, плазменного контроля и неразбавленных образцов плазмы в дубликатах к соответствующим скважинам пластины.
После уплотнения пластины, инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут с нежной тряски. В конце инкубации, мыть пластину три раза с 300 микролитров стирального раствора за задолго до добавления 100 микролитров пероксидаса спряженных анти-человеческих антител ТАТ к каждой хорошо. После 15-минутной инкубации при 37 градусах По Цельсию при встряхивании трижды вымойте тарелку 300 микролитров свежего раствора для мытья на колодец.
После последней стирки добавьте 100 микролитров свежеприготовленного раствора хрома на колодец для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте 100 микролитров стоп-раствора к каждой колодец и прочитайте оптическую плотность на фотометре на 490-500 нанометров, используя стандартные данные кривой в качестве линии тренда для расчета концентрации TAT каждого образца. Чтобы подготовить имплантаты для сканирования электронной микроскопии, используйте типсы, чтобы удалить имплантаты из труб и кратко промыть каждый имплантат три раза в свежем 0,9% хлорида натрия на стирку.
После последней стирки храните имплантаты в отдельных контейнерах 2%glutaraldehyde в PBS без кальция и магния на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро инкубировать имплантаты в отдельных контейнерах PBS в течение 10 минут, прежде чем обезвоживать имплантаты в восходящих концентрациях этанола в течение 10 минут на концентрацию, как указано. Непосредственно после сбора крови и перфузии, никаких изменений не обнаруживается в количестве белых или красных кровяных телец или в значениях гематокрита.
Тем не менее, снижение уровня гемоглобина обнаруживается после перфузии в системе цикла потока. Наблюдается также уменьшение количества тромбоцитов, что увеличивается, когда в трубе присутствует неокрашенный стент. Примечательно, что эта потеря уменьшается, когда кровь инкубируется стентом с фибрином-гепарином.
Комплексная концентрация ТАТ умеренно увеличивается в ответ на перфузию. Однако при добавлении голого металлического стента обнаруживается значительное увеличение ТАТ, что свидетельствует о глубокой активации системы коагуляции. Использование стента с покрытием фибрина-гепарина предотвращает эту активацию.
Перфузия приводит к повышенной активации комплимент каскада, который не зависит от наличия без покрытия или фибрин-гепарин покрытием стентов. Аналогичным образом, нейтрофил гранулоциты активируются, о чем свидетельствует количественная оценка уровней полиморфонуклеариловой нейтрофиловой эластазы. Визуализация путем сканирования электронной микроскопии показывает, что наличие плотной сети клеток крови и белков на поверхности неокрашенного стента после перфузии, которое не наблюдается на стентах с фибрином-гепарином.
Крайне важно подтвердить, что кровь соответствует критериям включения для получения образцов и использовать свеженатянутую кровь как можно быстрее. Человеческая кровь может содержать вирусы, передающихся через кровь и другие агенты и несет в себе риск заражения, поэтому не забудьте всегда носить соответствующие СИЗ при обработке образцов.
