Dieses Protokoll stellt ein Modell für die Hemokompatibilitätsuntersuchung von blutverstättigenden Geräten gemäß den Richtlinien der Internationalen Standardorganisation dar. Das Modell ist ideal für die Nachahmung der physiologischen Bedingungen, die dem Implantat entsprechen, da der niedrige Hintergrund für thrombotische Ereignisse und die niedrige Konzentration von Antikoagulanzien eine breite Analyse der Blutparameter ermöglichen. Diese Methode ist ideal für die Biomaterialforschung, da sie eine einfache Möglichkeit bietet, die Hämokompatibilität zu bewerten.
Darüber hinaus kann es für präklinische Studien verwendet werden. Für die Heparinbelastung mischen Sie zunächst 5 000 internationale Einheiten unverdünnten Heparins mit 0,9 % Natriumchlorid, um eine 15 internationale Einheit pro Milliliter Heparinkonzentration zu erhalten. Als nächstes fügen Sie 900 Mikroliter der verdünnten Heparin-Lösung zu drei neutralen Monovetten und drei reservierten Monovetten pro Spender hinzu und lagern die mit Heparin beladenen Monovetten bei vier Grad Celsius.
30 Minuten vor der Blutentnahme die Monovetten bei Raumtemperatur aufstellen. Wenn die Monovetten erwärmt haben, sammeln Sie neun Milliliter Blut in jedem der drei Monovetten pro Spender, bevor Sie alle 27 Milliliter Blut von jedem Spender in einem einzigen Plastikbehälter bündeln. Um die Durchflussschleife vorzubereiten, laden Sie mindestens ein Rohr pro Zustand mit dem neurovaskulären Laser geschnitten Implantat von Interesse und legen Sie ein Ende jeder Röhre in einem Reservoir mit 0,9% Natriumchlorid gefüllt.
Legen Sie ein unbeladenes Rohr in das Reservoir und verbinden Sie alle Rohre mit dem Pumpenkopf. Legen Sie dann das andere Ende jedes Rohres in einen Messzylinder ein und stellen Sie die Einstellungen der Peristaltikpumpe mit einem Timer auf einen Durchfluss von 150 Milliliter pro Minute ein, während Sie den Füllstand im Messzylinder überprüfen. Für Hämokompatibilitätstests verwenden Sie eine 12-Milliliter-Spritze, um jede Röhre mit sechs Milliliter Blut zu füllen.
Nach der Bildung eines Kreislaufs verwenden Sie eine 0,5 Zentimeter lange Silikon-Verbindungsschläuche, um die Rohre fest zu schließen und die Rohre in ein 37 Grad Celsius Wasserbad zu legen. Dann starten Sie die 60-Minuten-Röhre. Für die Blutbildanalyse fügen Sie 1,2 Milliliter nicht durchblutetes Blut oder 1,2 Milliliter Blut aus jeder Röhre nach der Durchblutung in einzelne Monovetten, die EDTA enthalten, hinzu.
Umdie Monovetten fünfmal vorsichtig umzudrehen und die Fläschchen in einen Blutanalysator für eine Blutbildanalyse jeder Probe zu laden. Am Ende der Analyse die Monovetten für 15-60 Minuten auf Eis legen. Für die Citrat-Plasma-Sammlung, füllen Sie Citrat-haltige Monovetten mit 1,4 Milliliter nicht durchblutem oder durchbluteligem Blut und invertieren Sie jede Monovette fünfmal sorgfältig.
Trennen Sie das Plasma durch Zentrifugation und übertragen Sie drei 250 Mikroliter Aliquots der Plasmafraktion in einzelne 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen. Dann frieren Sie die Plasmaproben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius bis zu ihrer Analyse. Für die EDTA-Plasmasammlung trennen Sie nach der Vier-Grad-Celsius-Inkubation nach der Blutbildmessung das Plasma durch Zentrifugation und übertragen drei 250 Mikroliter Aliquots der Plasmafraktion in einzelne 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen.
Dann die Plasmaproben in flüssigem Stickstoff für minus 20 Grad Celsius Lagerung einfrieren. Für die CTAD-Plasmasammlung CTAD-haltige Monovetten mit 2,7 Millilitern frisch gezogenem oder durchgeblutetem Blut füllen und die Röhrchen fünfmal sorgfältig invertieren. Legen Sie die Monovetten 15-60 Minuten auf Eis, bevor Sie das Plasma durch Zentrifugation sammeln.
700 Mikroliter jeder mittleren Plasmafraktion in einzelne 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen übertragen und die gefüllten Reaktionsröhrchen wieder zentrifugieren. Dann zwei 100 Mikroliter Aliquots der mittleren Fraktion in einzelne 1,5-Milliliter-Reaktionsrohre geben und die Rohre in flüssigem Stickstoff einfrieren, um sie bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Um die TAT-Werte in den Citratplasmaproben zu messen, fügen Sie 50 Mikroliter ELISA-Probenpuffer in jeden Brunnen einer 96-well flachen Bodenplatte und 50 Mikroliter Plasmastandard, Plasmakontrolle und unverdünnte Plasmaproben in Duplikaten in die entsprechenden Bohrguts der Platte ein.
Nach dem Abdichten der Platte die Proben bei 37 Grad Celsius 15 Minuten lang mit sanftem Schütteln bebrüten. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Platte dreimal mit 300 Mikroliter Waschlösung pro Brunnen, bevor Sie 100 Mikroliter Peroxidase konjugierten anti-humanen TAT-Antikörper zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schütteln den Teller dreimal mit 300 Mikroliter frischer Waschlösung pro Brunnen waschen.
Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter frisch zubereitete Chromogenlösung pro Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die optische Dichte auf einem Photometer bei 490 bis 500 Nanometern unter Verwendung der Standardkurvendaten als Trendlinie für die Berechnung der TAT-Konzentration jeder Probe ablesen. Um die Implantate für die Rasterelektronenmikroskopie vorzubereiten, verwenden Sie Zangen, um die Implantate aus den Röhrchen zu entfernen und jedes Implantat dreimal in frischem 0,9%Natriumchlorid pro Wäsche kurz zu spülen.
Nach der letzten Wäsche die Implantate in Einzelbehältern mit 2% Glutaraldehyd in PBS ohne Kalzium und Magnesium über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen die Implantate in einzelnen Behältern von PBS für 10 Minuten inkubieren, bevor die Implantate in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol für 10 Minuten pro Konzentration dehydriert werden, wie angegeben. Direkt nach der Blutentnahme und Perfusion werden keine Veränderungen in der Anzahl der weißen oder roten Blutkörperchen oder in den Hämatokritwerten festgestellt.
Jedoch, eine Abnahme der Hämoglobinspiegel wird nach perfusion innerhalb des Durchflussschleifensystems festgestellt. Eine Abnahme der Thrombozytenzahlen wird auch beobachtet, die erhöht wird, wenn ein unbeschichteter Stent innerhalb der Schläuche vorhanden ist. Insbesondere wird dieser Verlust reduziert, wenn das Blut mit einem Fibrin-Heparin-beschichteten Stent inkubiert wird.
Die TAT-Komplexkonzentration wird als Reaktion auf die Perfusion leicht erhöht. Wenn jedoch ein Nacktmetallstent zugegeben wird, wird eine signifikante Zunahme des TAT festgestellt, was auf eine tiefgreifende Aktivierung des Gerinnungssystems hindeutet. Die Verwendung eines fibrin-heparinbeschichteten Stents verhindert diese Aktivierung.
Perfusion führt zu einer erhöhten Aktivierung der Komplimentkaskade, die nicht durch das Vorhandensein von unbeschichteten oder fibrin-heparinbeschichteten Stents beeinflusst wird. In ähnlicher Weise werden neutrophile Granulozyten aktiviert, wie die Quantifizierung der polymorphonuklearen neutrophilen Elastase zeigt. Die Visualisierung durch Rasterelektronenmikroskopie zeigt, dass das Vorhandensein eines dichten Netzes von Blutzellen und Proteinen auf der Oberfläche des unbeschichteten Stents nach perfusion, das bei den fibrin-heparinbeschichteten Stents nicht beobachtet wird.
Es ist von größter Bedeutung zu bestätigen, dass das Blut die Aufnahmekriterien für die Gewinnung von Proben erfüllt und frisch entnommenes Blut so schnell wie möglich zu verwenden. Menschliches Blut kann blutübertragene Viren und andere Wirkstoffe enthalten und birgt das Risiko einer Infektion, also achten Sie darauf, bei der Handhabung der Proben immer geeignete PSA zu tragen.
