Este protocolo apresenta um modelo para a investigação de hemocompatibilidade de dispositivos de contato com sangue de acordo com as diretrizes da Organização Padrão Internacional. O modelo é ideal para imitar as condições fisiológicas que correspondem ao implante, uma vez que o baixo fundo para eventos trombóticos e a baixa concentração de anticoagulantes permitem uma ampla análise do parâmetro sanguíneo. Este método é ideal para pesquisa de biomateriais, pois fornece uma maneira simples de avaliar a hemocompatibilidade.
Além disso, pode ser usado para estudos pré-clínicos. Para carregamento de heparina, primeiro mix 5.000 unidades internacionais de heparina não diluída com cloreto de sódio de 0,9% para obter 15 unidades internacionais por mililitro de concentração de heparina. Em seguida, adicione 900 microliters da solução de heparina diluída a três monovetas neutras e três monovetas reservadas por doador e armazene os monivetes carregados de heparina a quatro graus Celsius.
30 minutos antes da coleta da amostra de sangue, coloque os monovetas à temperatura ambiente. Quando os monôvetas tiverem aquecido, colete nove mililitros de sangue em cada um dos três monivetes por doador antes de juntar todos os 27 mililitros de sangue de cada doador em um único recipiente plástico. Para preparar o laço de fluxo, carregue pelo menos um tubo por condição com o implante de corte a laser neurovascular de interesse e coloque uma extremidade de cada tubo em um reservatório cheio de cloreto de sódio de 0,9%.
Coloque um tubo descarregado no reservatório e conecte todos os tubos à cabeça da bomba. Em seguida, insira a outra extremidade de cada tubo em um cilindro de medição e ajuste as configurações da bomba peristáltica para uma taxa de fluxo de 150 mililitros por minuto usando um temporizador enquanto verifica o nível de preenchimento no cilindro de medição. Para testes de hemocompatibilidade, use uma seringa de 12 mililitros para encher cada tubo com seis mililitros de sangue.
Após formar um circuito, use um comprimento de 0,5 centímetro de tubo de conexão de silicone para fechar os tubos firmemente e colocar os tubos em um banho de água de 37 graus Celsius. Então inicie o tubo de 60 minutos. Para análise completa da contagem sanguínea, adicione 1,2 mililitros de sangue não perfumado ou 1,2 mililitros de sangue de cada tubo após a perfusão em monivetes individuais contendo EDTA.
Inverta cuidadosamente os monovetas cinco vezes e carregue os frascos em um analisador de sangue para uma análise de hemograma de cada amostra. Ao final da análise, coloque os monovetas no gelo por 15-60 minutos. Para a coleta de plasma citrato, encha monótares contendo citratos com 1,4 mililitros de sangue não perfumado ou perfumado e inverta cuidadosamente cada monovette cinco vezes.
Separe o plasma por centrifugação e transfira três alíquotas de 250 microliter da fração plasmática em tubos individuais de reação de 1,5 mililitro. Em seguida, congele as amostras de plasma em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 20 graus Celsius até sua análise. Para a coleta de plasma EDTA, após a incubação de quatro graus Celsius após a medição da contagem sanguínea, separe o plasma por centrifugação e transfira três alíquotas de 250 microliter da fração de plasma em tubos individuais de reação de 1,5 mililitro.
Em seguida, congele as amostras de plasma em nitrogênio líquido para menos 20 graus Celsius de armazenamento. Para a coleta de plasma CTAD, encha monótonas contendo CTAD com 2,7 mililitros de sangue recém-desenhado ou perfumado e inverta cuidadosamente os tubos cinco vezes. Coloque os monivetes no gelo por 15-60 minutos antes de coletar o plasma por centrifugação.
Transfira 700 microliters de cada fração de plasma médio em tubos de reação individuais de 1,5 mililitro e centrifugar os tubos de reação preenchidos novamente. Em seguida, transfira duas alíquotas de 100 microliter da fração média em tubos individuais de reação de 1,5 mililitro e congele os tubos em nitrogênio líquido para seu armazenamento a menos 20 graus Celsius. Para medir os níveis de TAT nas amostras de plasma citrato, adicione 50 microliters de tampão de amostra ELISA em cada poço de uma placa inferior plana de 96 poços e 50 microliters de padrão plasmátil, controle de plasma e amostras de plasma não diluídas em duplicatas aos poços apropriados da placa.
Depois de selar a placa, incubar as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos com agitação suave. No final da incubação, lave a placa três vezes com 300 microliters de solução de lavagem por bem antes de adicionar 100 microliters de anticorpo ANTI-HUMANO CONJUGADO peroxidase a cada poço. Depois de uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius com agitação, lave a placa três vezes com 300 microliters de solução de lavagem fresca por poço.
Após a última lavagem, adicione 100 microliters de solução cromogen recém-preparada por poço para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione 100 microliters de solução stop a cada poço e leia a densidade óptica em um fotômetro de 490 a 500 nanômetros usando os dados de curva padrão como linha de tendência para calcular a concentração de TAT de cada amostra. Para preparar os implantes para a microscopia eletrônica de varredura, use fórceps para remover os implantes dos tubos e enxágue brevemente cada implante três vezes em cloreto de sódio fresco de 0,9% por lavagem.
Após a última lavagem, armazene os implantes em recipientes individuais de 2%glutaraldeído em PBS sem cálcio e magnésio durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, incubar os implantes em recipientes individuais de PBS por 10 minutos antes de desidratar os implantes em concentrações ascendentes de etanol por 10 minutos por concentração, conforme indicado. Logo após a coleta e perfusão sanguínea, não são detectadas alterações no número de glóbulos brancos ou vermelhos ou nos valores hematócritos.
No entanto, uma diminuição nos níveis de hemoglobina é detectada após a perfusão dentro do sistema de loop de fluxo. Observa-se também uma diminuição no número de plaquetas, que é aumentada quando um stent não revestido está presente dentro da tubulação. Notavelmente, essa perda é reduzida quando o sangue é incubado com um stent revestido de fibrina-heparina.
A concentração do complexo TAT é ligeiramente aumentada em resposta à perfusão. Quando um stent metálico nu é adicionado, no entanto, um aumento significativo na TAT é detectado indicando uma ativação profunda do sistema de coagulação. O uso de um stent revestido de fibrina-heparina impede essa ativação.
A perfusão leva a uma ativação maior da cascata de elogios que não é afetada pela presença de stents revestidos de fibrina ou fibrina. Da mesma forma, os granulócitos neutrófilos são ativados como evidenciado pela quantificação dos níveis de elastróse de neutrófilos polimorfonucleares. A visualização por microscopia eletrônica de varredura revela que a presença de uma densa rede de células sanguíneas e proteínas na superfície do stent não revestido após a perfusão que não é observada nos stents revestidos de fibrina-heparina.
É de extrema importância confirmar que o sangue preenche os critérios de inclusão para a obtenção de amostras e para o uso de sangue recém-extraído o mais rápido possível. O sangue humano pode conter vírus transmitidos pelo sangue e outros agentes e carrega o risco de infecção, por isso certifique-se de sempre usar EPI apropriado ao manusear as amostras.
