يقدم هذا البروتوكول نموذجًا للتحقيق في قابلية الهيموفيوتيا لأجهزة الاتصال بالدم وفقًا لإرشادات المنظمة الدولية للمعايير. النموذج مثالي لمحاكاة الظروف الفسيولوجية التي تتوافق مع الزرع منذ الخلفية المنخفضة للأحداث الخثارية والتركيز المنخفض من مضادات التخثر تمكين تحليل واسع لمعلمة الدم. هذه الطريقة مثالية للبحوث الحيوية لأنها توفر طريقة بسيطة لتقييم القدرة على الهيموفياتي.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه للدراسات قبل الكلينيكية. لتحميل الهيبارين، أول مزيج 5،000 وحدة دولية من الهيبارين غير مخفف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم للحصول على 15 وحدة دولية لكل ملليلتر من تركيز الهيبارين. بعد ذلك، أضف 900 ميكروليتر من محلول الهيبارين المخفف إلى ثلاثة أحاديات محايدة وثلاثة أحاديات محفوظة لكل متبرع وتخزين أحاديات الهبارين المحملة بأربع درجات مئوية.
قبل 30 دقيقة من جمع عينة الدم، ضع الـ monovettes في درجة حرارة الغرفة. عندما تكون أحادية الحرارة، وجمع تسعة ملليلتر من الدم في كل من ثلاثة monovettes لكل متبرع قبل تجميع جميع 27 ملليلتر من الدم من كل متبرع في حاوية بلاستيكية واحدة. لإعداد حلقة التدفق، قم بتحميل أنبوب واحد على الأقل لكل حالة مع زرع الليزر العصبي الوعائي من الفائدة ووضع نهاية واحدة لكل أنبوب في خزان مملوء بـ 0.9٪ من كلوريد الصوديوم.
ضع أنبوبًا فارغًا في الخزان وربط جميع الأنابيب برأس المضخة. ثم أدخل الطرف الآخر من كل أنبوب في اسطوانة قياس وضبط إعدادات مضخة الغمر إلى معدل تدفق 150 ملليلتر في الدقيقة الواحدة باستخدام جهاز توقيت أثناء التحقق من مستوى التعبئة في اسطوانة القياس. لاختبار القدرة على الهيمواكية، استخدم حقنة 12 ملليلتر لملء كل أنبوب بستة ملليلترات من الدم.
بعد تشكيل دائرة، استخدم 0.5 سنتيمتر طول من السيليكون ربط أنابيب لإغلاق الأنابيب بإحكام ووضع الأنابيب في حمام الماء 37 درجة مئوية. ثم ابدأ الأنبوب لمدة 60 دقيقة. لتحليل تعداد الدم كله، إضافة 1.2 ملليلتر من الدم غير المشبع أو 1.2 ملليلتر من الدم من كل أنبوب بعد التسريب في أحادية الفردية التي تحتوي على EDTA.
عكس بعناية monovettes خمس مرات وتحميل قوارير في محلل الدم لتحليل تعداد الدم لكل عينة. في نهاية التحليل، ضع أحاديات على الجليد لمدة 15-60 دقيقة. لجمع البلازما سيترات، ملء أحاديات تحتوي على سترات مع 1.4 ملليلتر من الدم غير الم pered أو pered وعكس بعناية كل مونوفيت خمس مرات.
فصل البلازما عن طريق الطرد المركزي ونقل ثلاثة 250 ميكرولتر aliquots من جزء البلازما في الفردية 1.5 ملليلتر ردود الفعل أنابيب. ثم تجميد عينات البلازما في النيتروجين السائل وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية حتى تحليلها. لجمع البلازما EDTA، بعد الحضانة أربع درجات مئوية بعد قياس تعداد الدم، وفصل البلازما عن طريق الطرد المركزي ونقل ثلاثة 250 ميكرولتر aliquots من جزء البلازما إلى فردي 1.5 ملليلتر أنابيب التفاعل.
ثم تجميد عينات البلازما في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 20 درجة مئوية. لجمع البلازما CTAD، وملء CTAD التي تحتوي على monovettes مع 2.7 ملليلتر من الدم المسحوبة حديثا أو perfused عكس بعناية الأنابيب خمس مرات. ضع أحادية على الجليد لمدة 15-60 دقيقة قبل جمع البلازما عن طريق الطرد المركزي.
نقل 700 ميكرولترات من كل كسر البلازما المتوسطة في أنابيب التفاعل 1.5 ملليلتر الفردية والطرد المركزي أنابيب التفاعل شغل مرة أخرى. ثم نقل اثنين من 100 ميكرولتر aliquots من الكسر الأوسط في الفردية 1.5 ملليلتر ردود الفعل أنابيب وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل لتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. لقياس مستويات TAT في عينات البلازما سيترات، إضافة 50 ميكرولترات من العازلة عينة ELISA في كل بئر من 96 جيدا لوحة مسطحة أسفل و 50 ميكرولترات من معيار البلازما، ومراقبة البلازما، وعينات البلازما غير مخفف في التكرارات إلى الآبار المناسبة من لوحة.
بعد ختم لوحة، احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من محلول الغسيل في كل بئر قبل إضافة 100 ميكرولترات من بيروكسيديز متقارنة الأجسام المضادة تات المضادة للإنسان إلى كل بئر. بعد حضانة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز، وغسل لوحة ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من محلول الغسيل الطازجة في البئر.
بعد الغسيل الأخير، أضف 100 ميكرولترات من محلول الكروموجين الطازج المعدة بشكل جيد لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من حل التوقف إلى كل بئر وقراءة الكثافة البصرية على مقياس ضوئي في 490 إلى 500 نانومتر باستخدام بيانات منحنى القياسية كخط اتجاه لحساب تركيز تات لكل عينة. لتحضير الغرسات لفحص المجهر الإلكتروني، استخدم ملقط لإزالة الغرسات من الأنابيب وشطف كل غرسة ثلاث مرات في كلوريد الصوديوم الطازج 0.9٪لكل غسل.
بعد الغسيل الأخير، قم بتخزين الغرسات في حاويات فردية بنسبة 2٪ من الجلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، احتضان يزرع في حاويات فردية من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق قبل التجفيف يزرع في تركيزات تصاعدية من الإيثانول لمدة 10 دقيقة لكل تركيز كما هو مبين. مباشرة بعد جمع الدم و perfusion، يتم الكشف عن أي تغييرات في عدد من خلايا الدم البيضاء أو الحمراء أو في قيم الدماتوكريت.
ومع ذلك، يتم الكشف عن انخفاض في مستويات الهيموغلوبين بعد التسريب داخل نظام حلقة التدفق. ويلاحظ أيضا انخفاض في أعداد الصفائح الدموية، التي يتم زيادتها عندما الدعامة غير المصقولة موجودة داخل أنابيب. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الخسارة تنخفض عندما يتم احتضان الدم مع الدعامة المغلفة بالفيرين الهيبارين.
يتم زيادة تركيز معقّد تات أقلّيّة استجابة للضخ. ومع ذلك، عندما تضاف دعامة معدنية عارية، يتم الكشف عن زيادة كبيرة في TAT مما يدل على تنشيط عميق لنظام التخثر. استخدام الدعامة المغلفة بالفيبرين الهيبارين يمنع هذا التنشيط.
Perfusion يؤدي إلى زيادة تفعيل تتالي مجاملة التي لا تتأثر بوجود الدعامات غير المصقول أو الهبارين المغلفة. وبالمثل، يتم تنشيط حبيبات العدلات كما يتضح من القياس الكمي لمستويات العدلات المتعددة الأشكال. التصور عن طريق مسح المجهري الإلكترون يكشف عن وجود شبكة كثيفة من خلايا الدم والبروتينات على سطح الدعامة غير المصقول بعد الدعامة التي لم يلاحظها على الدعامات المغلفة بالفيربين الهيبارين.
من الأهمية بمكان التأكد من أن الدم يفي بمعايير الاشتمال للحصول على العينات واستخدام الدم المسحوب حديثاً في أسرع وقت ممكن. دم الإنسان قد تحتوي على الفيروسات المنقولة بالدم وغيرها من العوامل ويحمل خطر العدوى لذلك تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة دائما عند التعامل مع العينات.
