Этот протокол обеспечивает точный и воспроизводимый метод количественной оценки десяти различных липидных классов Saccharomyces cerevisiae с использованием одного метода извлечения и единого метода LC-MS. Этот метод позволяет обнаруживать и количественно выявлять изобарические и изомериковые липидные виды, имеющие различные химические и физические свойства. Для saccharomyces cerevisiae культуры, сначала добавить 5 мл стерильных 20% раствора запасов глюкозы в каждой из двух колб Erlenmeyer, содержащих стерильные YNB среды до конечной концентрации 2%глюкозы.
Затем используйте стерильную пипетку для передачи объема ночной дрожжевой культуры, содержащей пять раз десять- до седьмых дрожжевых клеток в каждую колбу и культуры колбы, по крайней мере 24 часов при 30 градусах по Цельсию с вращательной тряски на 200 оборотов в минуту. Для извлечения липидов, определить общее количество дрожжевых клеток на миллилитр культуры и передать пять раз десять седьмой клетки в 15 мл центрифуги трубки. Добавьте ледяную нано-чистую воду, чтобы довести общий объем до 15 мл и собрать клетки путем центрифугации.
Повторно приостановить дрожжевой гранулы в 15 мл ледяного изо-тонизирующего аммония бикарбонат буфер для второй центрифугации и повторно приостановить гранулы в 1,5 мл свежего ледяного аммония бикарбонатного раствора. В конце центрифугации храните гранулы при 80 градусах цельсия до извлечения. Чтобы начать экстракции липидов, оттаивать гранулы клетки на льду, прежде чем повторно приостановить клетки в 200 микролитров ледяной нано-чистой воды.
В паровой капот, передача подвески клетки на 15 мл, высокопрочное стекло, винт верхней центрифуги трубки с политетрафторэтилен выстроились крышка и добавить 25 микролитров внутренней смеси стандартов липидов, подготовленный в 2:1 хлороформ метанола. 100 микролитров от 425 до 600 микромолярной кислоты промывают стеклянные бусины и 600 микролитров хлороформного метанола 17:1 в трубку. Vortex трубки на высокой скорости в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы нарушить клетки.
Затем вихревые в течение одного часа на низкой скорости при комнатной температуре для облегчения извлечения липидов. В конце извлечения инкубировать образец в течение 15 минут на льду, для содействия белковых осадков и разделения аквеозных и органических фаз. В конце инкубации, центрифуга образца для дальнейшего отделить верхнюю фазу aqueous от нижней органической фазы и, в дым капот, использовать borosilicate стеклянная пипетка для передачи нижней органической фазы в новый 15 мл высокой прочности стекла винт верхней центрифуги трубки с политетрафтороэтилен выстроились крышкой.
Поместите нижнюю органическую фазу под поток азотного газа и, в дымовой капот, добавьте 300 микролитров смеси хлороформного метанола в оставшуюся верхнюю часть. Для облегчения фосфатидикацида, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитол и кардио-липидного экстракции вихрь трубки энергично в течение пяти минут при комнатной температуре до центрифугирования образца. Используйте борозиликатную стеклянную пипетку для переноса нижней органической фазы в нижнюю органическую фазу под азотом и испарения растворителя в комбинированных органических фазах в дымовой капоте.
Затем закройте трубки липидной пленки под потоком азотного газа и храните образцы при 80 градусах цельсия. Для жидкой хроматографии, разделение извлеченных липидов на 500 микролитров 63:35:5 ацето-нитрил-2-пропанол нано-чистой смеси воды в трубку липидной пленки и вихря три раза в течение десяти секунд на вихрь при комнатной температуре. Подавми содержимое трубки к ультразвуковой звуковой в течение 15 минут, прежде чем вихри трубки три раза в течение десяти секунд на вихрь, как только что продемонстрировали.
Перенесите 100 микролитров образца в стеклянный флакон со вставкой, используемой для 24 хорошо пластины и устранить любые пузырьки в вставке. Поместите вставку в один колодец пластины 24 хорошо и загрузите обратную фазу C18 колонки CSH в сочетании с предварительной колонкой в жидкой системе хроматографии. Установите температуру столбца до 55 градусов по Цельсию и поток до 300 микролитров в минуту.
Когда все параметры будут установлены, загрузите десять микролитров извлечения пустыми перед загрузкой первого образца. Затем отделяйте различные виды липидов, используя жидкий градиент хроматографии, как указано. Будет создана репрезентативная общая ионная хроматограмма из данных LC-MS для липидов, извлеченных из клеток.
Для масс-спектрометрического анализа извлеченных липидов загрузите образцы на масс-спектрометр, оснащенный нагретым источником ионизации электро-спрей, и установите параметры анализа, изложенные в таблице. Используйте анализатор Fourier Transform analyzer для обнаружения родительских ионов MS-1 с разрешением 60 000 и в пределах массового диапазона 150-2000 дальятов. Затем обнаружите вторичные ионы MS-2 с помощью настроек, указанных в таблице.
Для выявления и количественной оценки различных липидов из широкого тандема LC-MS файлов, поиск LC-MS сырые файлы, содержащие полное сканирование MS-1 данных и данных, зависящих от MS-2 данных бесплатно, неэстерифицированных жирных кислот, кардио-липиды, фитоцеримид, фитосфингоцен, фосфатидилхолин, фосфатидилеталамин, фосфатидлиглицерол, фосфатидлинозитол, фосфатидлидлерин и триацилглицерол липидные классы с использованием массы, разделенной на пять частей на миллион для ионов-предшественников. Затем следуйте инструкциям, представленным в руководстве пользователя программного обеспечения для выявления внутренних липидных стандартов и липидных видов с необычными составами жирных кислот. Этот чувствительный тандем LC-MS метод позволяет идентификации и количественной оценки молекулярных видов липидов в концентрациях, как низко как 0,165 пикомоляр на микролитр.
Этот предел количественной оценки отличается от различных классов липидов в широком диапазоне концентраций. Этот метод может быть использован для повышения эффективности ионизации липидов с помощью альтернативных мобильных фазовых добавок для масс-спектрометрии ионизации электроспрей. Каждая из этих альтернативных мобильных фазовых добавок может быть использована как для обычных фазовых, так и для обратных фазовых LC-столбцов.
Метод дисоциации, вызванный столкновением, полезен в сочетании с ацетатом ацетата аммония мобильной фазовой добавкой для электропысячи ионизации негативного режима масс-спектрометрии, так как в этих условиях позволяет повысить эффективность фрагментации липидов МС-1 в продукты МС-2. В отличие от этого, высокая энергия, метод столкновения диссоциации является благоприятным, если используется в сочетании с аммонием formate мобильной фазовой добавки для электро-спрей ионизации положительный режим масс-спектрометрии, как в этих условиях, это позволяет повысить эффективность MS-1 липидной ионной фрагментации в MS-2 продуктов. Не смешивайте фазы во время сбора органической фазы.
Закройте трубы под потоком азотного газа. Исключите любой пузырь в вставке и соедините столбец в правильном направлении. Если личность какого-либо пика не может быть определена LC-MS, MS-NMR может быть использован для вывода структуры этой молекулы.
