이 프로토콜은 단일 추출 방법과 단일 LC-MS 방법을 사용하여 Saccharomyces cerevisiae의 10가지 다른 지질 클래스를 정량화하는 정확하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 방법은 다른 화학 적 및 물리적 특성을 갖는 등류 및 이성질성 립질 종의 검출 및 정량화를 허용합니다. Saccharomyces cerevisiae 문화의 경우, 먼저 멸균 YNB 배지를 함유한 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 멸균 20%의 포도당 스톡 용액 5ml를 최종 농도인 2%의 포도당에 추가합니다.
이어서, 멸균 파이펫을 사용하여 7번째 효모 세포에 5배씩 함유된 야간 효모 배양을 각 플라스크로 옮기고 분당 200회전에서 회전흔들림으로 섭씨 30도에서 적어도 24시간 동안 플라스크를 배양한다. 지질 추출의 경우, 배양의 밀리리터 당 효모 세포의 총 수를 결정하고 15ml 원심분리기 튜브로 일곱 번째 세포로 5회 10번 을 이송한다. 얼음 차가운 나노 순수 한 물을 추가하여 총 부피를 최대 15ml까지 가져 와서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
효모 펠릿을 얼음 냉이 이소 토닉 암모늄 중탄산염 버퍼 15ml에 재중단하여 두 번째 원심분리를 하고 1.5ml의 신선한 얼음 차가운 암모늄 중탄산염 용액으로 펠릿을 다시 중단합니다. 원심 분리의 끝에, 추출 될 때까지 80섭씨에 펠릿을 저장합니다. 지질 추출을 시작하려면 얼음 에 세포 펠릿을 해동한 후 얼음 차가운 나노 순수 한 물의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.
연기 후드에서, 15ml, 고강도 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌 안감 캡나사 상단 원심분리기 튜브로 셀 서스펜션을 옮기고 2:1 클로로폼 메탄올로 제조된 내부 지질 표준 혼합물의 마이크로리터 25를 추가한다. 425~600마이크로몰라산 세척 유리 구슬 100마이크로리터와 튜브에 17:1 클로로폼 메탄올의 600 마이크로리터. 세포를 방해하기 위해 실온에서 5 분 동안 고속으로 튜브를 소용돌이시킵니다.
그 다음에는 실온에서 저속으로 1시간 동안 소용돌이를 가하여 지질 추출을 용이하게 합니다. 추출의 끝에서, 얼음에 15 분 동안 샘플을 배양, 단백질 강수량 및 수성 및 유기 단계의 분리를 촉진. 인큐베이션의 끝에서 원심분리는 상부 수성 상과 하부 유기상으로부터 의 상부 수성 위상을 더욱 분리하고, 연기 후드에서, 더 낮은 유기 상을 새로운 15ml 고강도 유리 스크류 상단 원심분리 튜브에 폴리테트라플루오로틸렌 라이닝 캡으로 전송한다.
질소 가스의 흐름 아래에 하부 유기 상을 놓고, 연기 후드에, 나머지 상부 수성 상에 2:1 클로로폼 메탄올 혼합물의 300 마이크로리터를 추가합니다. 인산염을 용이하게 하기 위해, 인산다이들세린, 포스파디딜리노시톨 및 심폐지질 추출 소용돌이는 샘플을 원심분리하기 전에 실온에서 5분 동안 적극적으로 튜브를 소용돌이시다. 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하여 질소 하에서 하부 유기 상으로 하부 유기상을 이송하고 연기 후드의 결합된 유기 상에서 용매를 증발시다.
그런 다음 질소 가스의 흐름 하에서 지질 필름의 튜브를 닫고 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 액체 크로마토그래피의 경우, 63:35:5 아세토-니트릴-2-프로파놀 나노 순수 수분 혼합물의 500 마이크로리터에서 추출된 지질을 실온에서 소용돌이 당 10초 동안 3회 지질필름과 소용돌이의 튜브로 분리한다. 튜브 내용내용을 초음파 초음파처리로 15분 간 피사체를 적용한 후 소용돌이당 10초 동안 튜브를 3회 피류로 피합니다.
24 웰 플레이트에 사용되는 인서트와 유리 유리 바이알에 샘플의 100 마이크로 리터를 전송하고 삽입 내에서 어떤 거품을 제거합니다. 인서트를 24웰 플레이트의 한 웰에 넣고 액체 크로마토그래피 시스템에 사전 열에 결합된 역상 C18 컬럼 CSH를 로드합니다. 기둥 온도를 섭씨 55도로 설정하고 흐름은 분당 300 마이크로리터로 설정합니다.
모든 매개 변수가 설정된 경우 첫 번째 샘플을 로드하기 전에 추출 공백10 마이크로리터를 로드합니다. 이어서, 표시된 바와 같이 액체 크로마토그래피 그라데이션을 사용하여 상이한 지질 종을 분리한다. 세포로부터 추출된 지질에 대한 LC-MS 데이터로부터의 대표적인 토탈 이온 크로마토그램이 생성될 것이다.
추출된 지질의 질량 분광 분석을 위해 가열된 전기 분무 이온 소스를 장착한 질량 분광계에 샘플을 적재하고 표에 설명된 대로 분석 매개 변수를 설정합니다. Fourier 변환 분석기를 사용하여 60, 000의 해상도와 150-2000 달톤의 질량 범위 내에서 MS-1 부모 이온을 감지합니다. 그런 다음 테이블에 표시된 설정을 사용하여 MS-2 보조 이온을 감지합니다.
광범위한 탠덤 LC-MS 파일에서 다른 지질을 식별하고 정량화하려면 전체 스캔 MS-1 데이터와 데이터 종속 MS-2 데이터를 포함하는 LC-MS 원시 파일을 검색하여 무료, 비esterified 지방산에 대해 검색하고, 심장 지질, 식물성 세필리미드, 피토스피렌고센, 포스파디델콜린, 포스파디에틸라민, 인스파티들글리세롤, 인스파티들리노시톨리톨, 인스파티들세린 및 트리아킬글리세롤 지질 클래스는 100만 개당 100만 개의 분당 과전오차로 나누어 져 있다. 그런 다음 소프트웨어 사용자 매뉴얼에 제공된 지침을 따라 내부 지질 표준 및 지질 종을 특이한 지방산 조성물로 식별합니다. 이 민감한 탠덤 LC-MS 방법은 마이크로리터 당 0.165 피코몰라의 농도에서 지질의 분자 종의 식별 및 정량화를 가능하게 한다.
정량화의 이 한계는 농도의 넓은 범위 내의 다른 지질 클래스와 다릅니다. 이 방법은 전기분무분화 질량 분광에 대한 대체 이동상 첨가제를 사용하여 지질에 대한 이온화의 효율을 높이는 데 사용될 수 있다. 이러한 대체 모바일 위상 첨가제는 각각정상 위상 및 역상 LC 컬럼모두에 사용될 수 있습니다.
충돌 유도 해리 방법은 질량 분석의 전기 분무 이온화 음성 모드용 암모늄 아세테이트 모바일 상 첨가제와 병용하는 경우, 이러한 조건하에서 MS-1 지질 이온 단편화의 효율을 MS-2 제품으로 증가시킬 수 있게 한다. 대조적으로, 고에너지, 충돌해리 방법은 이러한 조건하에서와 같이 질량 분석의 전기 분무 양성 모드에 대한 암모늄용 암모늄포메이트 모바일 상 첨가제와 함께 사용하는 경우, MS-2 제품으로 의 MS-1 지질 이온 단편화의 효율을 높일 수 있게 한다. 유기 상을 수집하는 동안 위상을 혼합하지 마십시오.
질소 가스의 흐름 하에서 튜브를 닫습니다. 삽입 내의 거품을 제거하고 컬럼을 올바른 방향으로 연결합니다. 어떤 피크의 ID가 LC-MS에 의해 결정될 수 없는 경우에, MS-NMR는 그 분자의 구조물을 추론하기 위하여 이용될 수 있습니다.
