Dieses Protokoll bietet eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung von zehn verschiedenen Lipidklassen von Saccharomyces cerevisiae mit einer einzigen Extraktionsmethode und einer einzigen LC-MS-Methode. Diese Methode ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von isobarischen und isomerischen Lipidarten mit unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften. Für Saccharomyces cerevisiae Kultur, fügen Sie zuerst 5 ml sterile 20%Glukose-Stammlösung zu jedem von zwei Erlenmeyer-Flaschen mit sterilem YNB-Medium bis zu einer Endkonzentration von 2%Glukose.
Dann verwenden Sie eine sterile Pipette, um ein Volumen einer über Nacht Hefekultur mit fünf mal zehn bis siebten Hefezellen in jeden Kolben und Kultur die Kolben für mindestens 24 Stunden bei 30 Grad Celsius mit Rotationsschütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute zu übertragen. Für die Lipidextraktion bestimmen Sie die Gesamtzahl der Hefezellen pro Milliliter Kultur und übertragen sie fünfmal zehn in die siebte Zelle in ein 15 ml Zentrifugenrohr. Fügen Sie eiskaltes nanoreines Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf bis zu 15 ml zu erhöhen und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln.
Das Hefepellet in 15 ml eiskaltem isotonischem Ammoniumbicarbonatpuffer für eine zweite Zentrifugation wieder aufsetzen und das Pellet in 1,5 ml frischer eiskalter Ammoniumbicarbonatlösung wieder aufhängen. Am Ende der Zentrifugation das Pellet bei 80 Grad Celsius bis zur Extraktion lagern. Um die Lipidextraktion zu beginnen, tauen Sie das Zellpellet auf Eis auf, bevor Sie die Zellen in 200 Mikroliter eiskaltes nanoreines Wasser wieder aufhängen.
In einer Dunstabzugshaube die Zellsuspension in ein 15 ml, hochfestes Glas, Schraube Oben Zentrifugenrohr mit einer Polytetrafluorethylen gefüttertkappe übertragen und 25 Mikroliter eines internen Lipid-Standardgemisches hinzufügen, in 2:1 Chlorform-Methanol hergestellt. 100 Mikroliter 425 bis 600 Mikromolarsäure gewaschen Glasperlen und 600 Mikroliter eines 17:1 Chloroform Methanol in die Röhre. Wirbeln Sie die Röhre mit hoher Geschwindigkeit für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu stören.
Gefolgt von Wirbeln für eine Stunde bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur, um die Lipidextraktion zu erleichtern. Am Ende der Extraktion die Probe 15 Minuten lang auf Eis bebrüten, um die Proteinfällung und die Trennung der wässrigen und organischen Phasen zu fördern. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Probe, um die obere wässrige Phase weiter von der unteren organischen Phase zu trennen, und verwenden Sie in der Rauchhaube eine Borosilikatglaspipette, um die untere organische Phase auf ein neues 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe zu übertragen.
Die untere organische Phase unter den Fluss von Stickstoffgas stellen und in der Dunstabzugshaube 300 Mikroliter eines 2:1 Chloroform-Methanol-Gemischs in die verbleibende obere wässrige Phase geben. Um Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Kardio-Lipid-Extraktionswirbel die Röhre kräftig für fünf Minuten bei Raumtemperatur vor zentrifugieren der Probe zu erleichtern. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glaspipette, um die untere organische Phase unter Stickstoff in die untere organische Phase zu übertragen und das Lösungsmittel in den kombinierten organischen Phasen in der Dunstabzugshaube zu verdampfen.
Schließen Sie dann die Rohre von Lipidfolie unter dem Fluss von Stickstoffgas und speichern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius. Für die Flüssigchromatographie die Trennung der extrahierten Lipide bei 500 Mikrolitern eines 63:35:5 Aceto-Nitrile-2-Propanol Nano-Reinenwassergemisches in die Röhre von Lipidfilm und Wirbel dreimal für zehn Sekunden pro Wirbel bei Raumtemperatur. Unterziehen Sie den Rohrinhalt 15 Minuten lang einer Ultraschallbeschallung, bevor Sie das Rohr dreimal für zehn Sekunden pro Wirbel wirbeln lassen, wie gerade gezeigt.
100 Mikroliter der Probe in eine Glasflasche mit einem Einsatz für eine 24-Well-Platte geben und Blasen innerhalb des Einsatzes beseitigen. Legen Sie den Einsatz in einen Brunnen einer 24-Well-Platte und laden Sie eine Reverse-Phase C18-Säule CSH gekoppelt an eine Vorsäule in das Flüssigchromatographie-System. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 55 Grad Celsius und den Durchfluss auf 300 Mikroliter pro Minute ein.
Wenn alle Parameter festgelegt sind, laden Sie zehn Mikroliter eines Extraktionsrohlings, bevor Sie die erste Probe laden. Trennen Sie dann die verschiedenen Lipidarten mit dem flüssigen Chromatographiegradienten, wie angegeben. Es wird ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm aus den LC-MS-Daten für die aus den Zellen extrahierten Lipide erzeugt.
Für die massenspektrometrische Analyse der extrahierten Lipide laden Sie die Proben auf ein Massenspektrometer, das mit einer beheizten Elektro-Sprüh-Ionen-Ionenquelle ausgestattet ist, und legen Sie die in der Tabelle beschriebenen Analyseparameter fest. Verwenden Sie den Fourier Transform Analyzer, um MS-1-Elternionen mit einer Auflösung von 60 000 und im Massenbereich von 150-2000 Daltons zu erkennen. Erkennen Sie dann die MS-2-Sekundärionen mithilfe der in der Tabelle angegebenen Einstellungen.
Um verschiedene Lipide aus breiten Tandem-LC-MS-Dateien zu identifizieren und zu quantifizieren, suchen Sie LC-MS-Rohdateien mit vollständigen Scan-MS-1-Daten und datenabhängigen MS-2-Daten kostenlos, unesterifizierte Fettsäuren, Cardio-Lipid, Phytocerimid, Phytosphyngocen, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatydlglycerol, Phosphatydlinositol, Phosphatydlserin und Triacylglycerol Lipidklassen unter Verwendung einer Masse geteilt durch Ladungstoleranz von fünf Teilen pro Million für Vorläuferionen und zehn Teile pro Million für Produktionen. Folgen Sie dann den Anweisungen in der Bedienungsanleitung der Software, um interne Lipidstandards und Lipidarten mit ungewöhnlichen Fettsäurezusammensetzungen zu identifizieren. Diese empfindliche Tandem-LC-MS-Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung molekularer Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,165 Picomolar pro Mikroliter.
Diese Quantifizierungsgrenze unterscheidet sich von verschiedenen Lipidklassen innerhalb eines breiten Konzentrationsspektrums. Diese Methode kann verwendet werden, um die Effizienz der Ionisation für Lipide durch den Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie zu erhöhen. Jeder dieser alternativen mobilen Phasenadditive kann sowohl für die normale Phase als auch für die Reverse-Phase-LC-Säulen verwendet werden.
Die kollisionsinduzierte Dissoziationsmethode ist vorteilhaft, wenn sie in Kombination mit dem mobilen Ammoniumacetat-Phasenadditiv für die Elektro-Spray-Ionisation sentolische negative Art der Massenspektrometrie verwendet wird, da sie unter diesen Bedingungen die Effizienz der MS-1 Lipidionenfragmentierung in MS-2-Produkte ermöglicht. Im Gegensatz dazu ist die hochenergetische, kollisionsfreie Dissoziationsmethode günstig, wenn sie in Kombination mit dem ammoniumformate mobilen Phasenadditiv für die Elektro-Sprühion-positive Art der Massenspektrometrie verwendet wird, da sie unter diesen Bedingungen eine Effizienzsteigerung der MS-1 Lipidionenfragmentierung in MS-2-Produkte ermöglicht. Mischen Sie die Phasen nicht beim Sammeln der organischen Phase.
Schließen Sie die Rohre unter dem Stickstoffgasstrom. Beseitigen Sie eine Blase innerhalb des Inserts und verbinden Sie die Spalte in die richtige Richtung. Wenn die Identität eines Peaks nicht durch LC-MS bestimmt werden kann, kann MS-NMR verwendet werden, um die Struktur dieses Moleküls abzuleiten.
