Este protocolo fornece um método preciso e reprodutível para quantificar dez classes lipídicas diferentes de Saccharomyces cerevisiae usando um único método de extração e um único método LC-MS. Este método permite a detecção e quantificação de espécies lipídicas isobáricas e isomericas com diferentes propriedades químicas e físicas. Para a cultura saccharomyces cerevisiae, adicione primeiro 5 ml de solução de estoque de glicose estéril de 20% para cada um dos dois frascos erlenmeyer contendo meio YNB estéril a uma concentração final de 2%de glicose.
Em seguida, use uma pipeta estéril para transferir um volume de uma cultura de levedura durante a noite contendo cinco vezes dez para as sétimas células de levedura em cada frasco e cultura os frascos por pelo menos 24 horas a 30 graus Celsius com agitação rotacional a 200 revoluções por minuto. Para extração lipídica, determine o número total de células de levedura por mililitro de cultura e transfira cinco vezes dez para a sétima célula em um tubo de centrífuga de 15 ml. Adicione água nano-pura gelada para aumentar o volume total até 15 ml e coletar as células por centrifugação.
Suspenda a pelota de levedura em 15 ml de tampão de bicarbonato de amônio iso-tônico gelado para uma segunda centrifugação e suspenda a pelota em 1,5 ml de solução de bicarbonato de amônio frio fresco. No final da centrifugação, armazene a pelota a 80 graus celsius até a extração. Para começar a extração lipídica, descongele a pelota celular no gelo antes de suspender as células em 200 microliters de água nano-pura gelada.
Em um capô de fumaça, transfira a suspensão celular para uma mistura de 15 ml, vidro de alta resistência, tubo de centrífuga de rosca superior com uma tampa forrada de politetrafluoroetileno e adicione 25 microlitros de uma mistura interna de padrões lipídicos, preparado em metanol clorofórmio 2:1. 100 microliters de 425 a 600 contas de vidro lavadas com ácido micromolar e 600 microliters de um metanol clorofórmio 17:1 para o tubo. Vórtice o tubo em alta velocidade por cinco minutos à temperatura ambiente para interromper as células.
Seguido por vórtice por uma hora a baixa velocidade à temperatura ambiente para facilitar a extração lipídica. Ao final da extração, incubar a amostra por 15 minutos no gelo, para promover a precipitação proteica e a separação das fases aquosas e orgânicas. Ao final da incubação, centrifugar a amostra para separar ainda mais a fase aquosa superior da fase orgânica inferior e, na capa de fumaça, use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior para um novo tubo de centrífugo de vidro de alta resistência de 15 ml com uma tampa forrada politefluoroetileno.
Coloque a fase orgânica inferior sob o fluxo de gás nitrogênio e, na capa de fumaça, adicione 300 microliters de uma mistura de metanol clorofórmio 2:1 à fase aquosa superior restante. Para facilitar o vórtice de fosfattidicad, fosfatidylserine, fosphatidylinositol e extração cardio-lipídica o tubo vigorosamente por cinco minutos à temperatura ambiente antes de centrifugar a amostra. Use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior para a fase orgânica inferior sob nitrogênio e evaporar o solvente nas fases orgânicas combinadas na capa de fumaça.
Em seguida, feche os tubos de filme lipídico sob o fluxo de gás nitrogênio e armazene as amostras a 80 graus celsius. Para cromatografia líquida, separação dos lipídios extraídos a 500 microliters de uma mistura de água nano-pura de aceto-nitrílico-2-propanol ao tubo de filme lipídado e vórtice três vezes por dez segundos por vórtice à temperatura ambiente. Sujeito o conteúdo do tubo à sônica ultrassônica por 15 minutos antes de vórtice do tubo três vezes por dez segundos por vórtice como apenas demonstrado.
Transfira 100 microliters da amostra em um frasco de vidro com uma inserção usada para uma placa de 24 poços e elimine quaisquer bolhas dentro da pastilha. Coloque a inserção em um poço de uma placa de 24 poços e carregue uma fase inversa C18 coluna CSH acoplado a uma pré-coluna no sistema de cromatografia líquida. Coloque a temperatura da coluna em 55 graus celsius e o fluxo para 300 microliters por minuto.
Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, carregue dez microlitadores de uma extração em branco antes de carregar a primeira amostra. Em seguida, separe as diferentes espécies lipídicas usando o gradiente de cromatografia líquida, conforme indicado. Um cromatograma de íon total representativo dos dados de LC-MS para os lipídios extraídos das células será gerado.
Para análise espectrométrica de massa dos lipídios extraídos, carregue as amostras em um espectrômetro de massa equipado com uma fonte de íons de íons de íons eletro-spray aquecido e defina os parâmetros de análise conforme descrito na tabela. Use o Fourier Transform Analyzer para detectar íons-mãe MS-1 com uma resolução de 60.000 e dentro da faixa de massa de 150-2000 daltons. Em seguida, detecte os íons secundários MS-2 usando as configurações indicadas na tabela.
Para identificar e quantificar diferentes lipídios de arquivos LC-MS amplos, pesquise arquivos brutos LC-MS contendo dados MS-1 e dados MS-2 dependentes de dados para ácidos graxos gratuitos e não esterocidos, cardio-lipídicos, fitocerimídeos, fitosfito, fosfattidylcolina, fosfatidylethanolamina, fosphatydlglycerol, fosphatydlinositol, fosphatydlserine e triacylglycerol lipid classes usando uma massa dividida pela tolerância de carga de cinco partes por milhão para íons precursores e dez partes por milhão para ions de produtos. Em seguida, siga as instruções fornecidas no manual do usuário do software para identificar padrões lipídes internos e espécies lipídicas com composições incomuns de ácidos graxos. Este método sensível tandem LC-MS permite a identificação e quantificação de espécies moleculares de lipídios em concentrações tão baixas quanto 0,165 picomolar por microliter.
Este limite de quantificação difere de diferentes classes lipídicas dentro de uma ampla gama de concentrações. Este método pode ser usado para aumentar a eficiência da ionização para lipídios usando aditivos de fase móvel alternativos para a espectrometria de massa de ionização eletrospray. Cada um desses aditivos de fase móvel alternativos pode ser usado tanto para as colunas LC de fase normal quanto para a fase inversa.
O método de dissociação induzido por colisão é benéfico se usado em combinação com o aditivo de fase móvel de acetato de amônio para o modo negativo de espectrometria de massa, pois, nessas condições, permite o aumento da eficiência da fragmentação da íon lipídica MS-1 em produtos MS-2. Em contraste, o método de dissociação de alta energia e colisão é favorável se usado em combinação com o aditivo de fase móvel formato de amônio para o modo positivo de espectrometria de massa eletro-spray, pois nessas condições, permite um aumento na eficiência da fragmentação da íon lipídica MS-1 em produtos MS-2. Não misture as fases durante a coleta da fase orgânica.
Feche os tubos sob o fluxo de gás nitrogênio. Elimine qualquer bolha dentro da inserção e conecte a coluna na direção correta. Se a identidade de qualquer pico não puder ser determinada por LC-MS, o MS-NMR pode ser usado para deduzir a estrutura dessa molécula.
