Трансплантация островка является одним из наиболее перспективных подходов к лечению сахарного диабета I типа. И поиск подходящего участка для пересадки островка продолжается. Пересадка островка в паховую подкожно-белую жировую ткань является простым, но эффективным методом, который может иметь клинические последствия.
Экстраполяция этой процедуры в клинику может привести к разработке лекарства для диабетиков I типа. Этот метод может дать представление о клинической трансплантации островка, как лингвистический было установлено, что не является идеальным местом для островка engraftment. Важно внимательно следить за каждым этапом процедуры, особенно ключевые шаги, такие как пищеварение поджелудочной железы.
Визуальная демонстрация поможет исследователям, новым для техники, лучше определить, как выполнять изоляцию островка и трансмутацию. Для сбора островка, первый спрей меха 10 недель назад C57 черный шесть мыши с 75%этанола, и заполнить пять миллилитров шприц со свежеприготовленным раствором коллагеназы. Оборудовать шприц с 32-го калибра изгиб тупой указал перфузии иглы, и поместите мышь в положение на спине на мешок со льдом.
Используйте прямые остроконечные офтальмологические ножницы, чтобы сделать поперечное отверстие в коже лобковой области, и расширить разрез к голове животного. Полностью откройте брюшную полость через V-разрез от лобковой области к процессу xiphoid, и двигайтесь печеночной клеткой для того чтобы подвергнуть действию желчный пузырь и всю длину общего желчного протока. Затем используйте сосудистый зажим, чтобы закрыть двенадцатиперстную часть общего желчного протока и сократить небольшое отверстие в желчном пузыре.
Cannulate общий желчный проток через отверстие с ранее подготовленной перфузионной иглой, и вводить около двух миллилитров раствора коллагеназы в поджелудочной железе. Когда все коллагеназы была доставлена, использовать две пары неинвазивных микро пинцетом, чтобы отделить пролитую поджелудочную железу от кишечника, желудка и селезенки, и поместите поджелудочной железы в 50 миллилитров конической трубки на льду. Когда все образцы были собраны, добавить 100 микролитров Dnase I на поджелудочную железу в 50 миллилитров труб и энергично встряхнуть каждую трубку около 40 раз в течение 10 секунд, прежде чем поместить ткани в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение трех-пяти минут с умеренной тряски.
В конце инкубации добавьте до конечного объема 50 миллилитров Stop Solution, чтобы остановить пищеварение. И импульс центрифуга труб со скоростью 750 раз G при четырех градусах по Цельсию, прежде чем быстро остановить центрифугу. После отказа от супернатантов, мыть гранулы два раза в 15 до 25 миллилитров Stop Solution на стирку в тех же условиях центрифугации, как только что продемонстрировали.
После второй стирки, бассейн три гранулы на трубку в новые 50 миллилитров конических труб. И повторное увеличение клеток поджелудочной железы в общей сложности десять миллилитров Histopaque 1119. Затем аккуратно добавьте пять миллилитров Histopaque 1077 вниз по стороне каждой трубки, а затем пять миллилитров HBSS.
Разделите клетки по центрифуге и используйте пятими миллилитровую пипетку Pasteur для сбора островков из интерфейса HBSS Histopaque 1077. Бассейн островки в новой 50 миллилитров конической трубки в окончательном объеме 50 миллилитров Stop Solution для центрифугации импульса, и отказаться от супернатанта. Переусердствов гранулы в 30 миллилитров свежего стоп-раствора в течение одной минуты центрифугации, и повторно посовещения островков в 30 миллилитров среды культуры.
Decant островки в один 10 сантиметров светоемкие культуры блюдо на трубку. И поместите блюдо под стерео микроскопом. Используя 200 микролитров гель-загрузки пипетки советы, стороны забрать белые сфероидальные островки из раствора.
Размещение островков в необработанные клетки культуры блюдо, содержащее 10 миллилитров культуры среды, как они собирают. Проверьте чистоту подобранных островков путем окрашивания дитизона под легким микроскопом. И обнаружить жизнеспособность островков с помощью фторцеина диацетата йодидия окрашивания под флуоресцентным микроскопом.
Затем культуры изолированных островков в свежей среде культуры при 37 градусов по Цельсию в 95%воздуха и 5%углекислого газа до трансплантации. Начиная дни три и четыре после индукции диабета, прокол хвостовой вены каждого стрептозотоцина вводили восемь недель старый мужчина C57 черный шесть мышей около 10:00 а.m., чтобы собрать образец крови от каждого животного-получателя.
Используйте базовый инструмент мониторинга глюкозы в крови, чтобы определить не-быстрый уровень глюкозы в крови каждой мыши, а затем добавить кровь на отдельные тест-полоски. Когда животное продемонстрировало уровень глюкозы в крови не менее 20 миллимолей на литр два дня подряд, взвесить и отметить мышь-получателя и подтвердить отсутствие реакции на педаль рефлекс в анестезированные животные. Поместите алицит гидрогеля от минус 20 градусов по Цельсию хранения на льду для оттаивания.
И передать от 450 до 500 островок эквивалентов на получателя в стерильные 1,5 миллилитровую центрифугу трубку, содержащую 200 микролитров среднего на трубку на льду. Шваб левой паховой области получателя с 75%этанола и поместите мышь в положение на спине. Исправить конечностей с хирургической лентой, и использовать клиперы, чтобы удалить волосы вокруг хирургического сайта.
Шваб хирургической области с иодофором и сделать вертикальный разрез в дезинфицированной кожи. Определите нижняя эпигастральной артерии и вены в ISWAT и создать небольшой карман над сосудами. Осадок островков центрифугации и удалить столько супернатантов, как это возможно.
Добавьте 20 микролитров разморожевания гидрогеля в каждую трубку и аккуратно будем повторно использовать островки, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков. Когда однородная подвеска была получена, используйте 200 микролитровый наконечник пипетки, чтобы тщательно доставить всю смесь гидрогеля островка из одной трубки в карман. Когда гидрогель полностью затвердело, добавьте 20 микролитров цефалоспорина к месту трансплантации и закройте мышцы и кожу 5-0 непрерывным хирургическим швом.
Затем поместите получателя в чистую клетку на тепловой площадке с мониторингом до полного лежачих. После обработки островков мурина, как попродемонстрировано, изолированные островки мурина будут достаточно чистыми для трансплантации. Для трансплантации следует использовать только изолированные островки с высокой жизнеспособностью.
После тщательного смешивания островк трансплантатов с гидрогелем, трансплантат может быть имплантирован в сайт ISWAT. Примерно через месяц после трансплантации в ISWAT, островок трансплантатов обратной гипергликемии в то время как вес тела мышей-реципиентов постепенно увеличивается. Через 100 дней после трансплантации удаление трансплантатов приводит к немедленному увеличению в 10:00 .m.
неэстивный уровень глюкозы в крови. Гистологический анализ на данный момент, показывает, что островок трансплантаты остались нетронутыми. А инсулин и глюкагон иммунофлуоресцентное окрашивание указывают на то, что пересаженые островки также функционируют при 100 днях после трансплантации.
Будьте осторожны, чтобы не встряхнуть пролитые клетки поджелудочной железы слишком надежно, иначе способность полученных островков будет скомпрометирована. Изолированные островки могут быть пересажены под почечной капсулой в качестве контроля, чтобы сравнить последствия изолированной трансплантации в подкожной подкожной белой жировой ткани в месте. Процедура добавит начало клинических испытаний трансплантации островка к другим участкам, кроме печени.
