小子移植は、I型糖尿病を治療するための最も有望なアプローチの1つです。そして、小地移植に適した場所の探索が進行中です。皮下白脂肪組織への小子移植は、臨床的な意味を持つ可能性のある単純でありながら効果的な方法である。
この手順をクリニックに外挿すると、I型糖尿病患者の治療法が開発される可能性があります。この方法は、言語が小地の生着のための理想的な部位ではないと判断されたように、臨床小地移植への洞察を提供することができる。手順のすべてのステップ、特に膵臓消化などの重要なステップに注意深く従うことが重要です。
視覚的なデモンストレーションは、この技術に新しい研究者が、小口分離と突然変異を実行する方法をより良く決定するのに役立ちます。小地の収穫のために、最初に75%エタノールで10週齢のC57ブラックシックスマウスの毛皮をスプレーし、5ミリリットルのシリンジに作りたてのコラゲラーゼ溶液を充填します。32ゲージの曲げ鈍い尖った灌流針を注射器に装備し、マウスをアイスバッグの上のスペピンの位置に置きます。
まっすぐ尖った眼科のはさみを使用して陰部の皮膚に横の開口部を作り、切開を動物の頭部に向かって伸ばします。恥部からxiphoidプロセスへのV-切開を介して腹部を完全に開き、胆嚢および共通胆管の全長を露出させるために肝臓を動かす。次に、血管クランプを使用して、共通の胆管の十二指腸開口部を閉じ、胆嚢の小さな開口部を切断します。
以前に準備した灌流針で開口を通して共通の胆管をカンニュレートし、約2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を膵臓に注入する。すべてのコラゲナーゼが送達されたら、2組の非侵襲的なマイクロピンセットを使用して、浸透した膵臓を腸、胃、脾臓から分離し、膵臓を氷の上の50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。すべてのサンプルが採取されたら、膵臓1個につき100マイクロリットルのDnaSEを50ミリリットルチューブに加え、10秒間にわたって各チューブを約40回激しく振ってから、適度な揺れで3〜5分間37度の水浴に入れます。
インキュベーションの最後に、消化を阻止するためにストップソリューションの50ミリリットルの最終体積に追加します。そして、速く遠心分離機を停止する前に、摂氏4度で750倍Gの速度にチューブをパルス遠心分離します。上清を捨て、ちょうど実証したように同じ遠心状態で洗浄1回15〜25ミリリットルのストップ溶液でペレットを2回洗浄します。
2回目の洗浄後、チューブあたり3つのペレットを新しい50ミリリットル円錐形チューブにプールします。そして、ヒスト不透明1119の10ミリリットルの総体積で膵臓細胞を再懸濁する。次に、各チューブの側面にヒスト不透明な1077の5ミリリットルを慎重に追加し、その後に5ミリリットルのHBSSを追加します。
遠心分離によって細胞を分離し、HBSSヒスト不透明1077インターフェイスから小島を収集するために5ミリリットルパスツールピペットを使用しています。新しい50ミリリットルの円錐形チューブに小島を50ミリリットルの最終体積のストップソリューションでプールしてパルス遠心分離を行い、上清を捨てます。ペレットを30ミリリットルの新鮮な停止溶液で1分間の遠心分離のために再懸濁し、30ミリリットルの培養培地で島を再懸濁する。
小島をチューブあたり10センチメートルの軽密培養皿にデカントします。そして、ステレオ顕微鏡の下に皿を置きます。200マイクロリットルのゲルローディングピペットチップを使用して、溶液から白い回転楕円体小島を手で選びます。
10ミリリットルの培養培地を収穫する際に、未処理の細胞培養皿に小島を入れる。軽顕微鏡でジチゾン染色することにより、手摘み小島の純度を確認します。フロレス化顕微鏡下でヨウ化プロピジウム染色をしたフルオレセイン・ジアセテート・ジアセテートで、小島の生存率を検出した。
その後、分離した島を95%の空気で摂氏37度、移植まで5%の二酸化炭素で新鮮な培養培地で培養する。糖尿病誘導後3日目と4日目から、各レンサプトゾトシン注射8週齢8週間齢の雄C57黒6マウスの尾静脈を10:00a.m頃に穿刺し、各レシピエント動物から血液サンプルを採取する。
基本的な血糖値モニタリング器具を使用して、各マウスの非空腹時血糖値を決定し、個々のテストストリップに血液を追加します。動物が2日連続で1リットル当たり少なくとも20ミリモルの血糖値を実証した場合、レシピエントマウスの体重を量ってマークし、麻酔動物のペダル反射に対する応答の欠如を確認する。解凍のために氷の上にマイナス20度の摂氏貯蔵からヒドロゲルのアリコートを置きます。
そして、1回の受取人あたり450〜500の島分を、氷上のチューブあたり200マイクロリットルの培地を含む無菌1.5ミリリットル遠心管に移します。レシピエントの左のインジナル領域を75%エタノールでスワブし、マウスをスピーヌ位置に置きます。手術用テープで手足を固定し、バリカンを使用して外科現場の周りの毛髪を取り除きます。
ヨードファーで手術領域をスワブし、感染した皮膚に垂直切開を行います。ISWAT内の下側の上頭動脈と静脈を特定し、血管の上に小さなポケットを作成します。遠心分離によって島を沈降し、できるだけ多くの上清を除去する。
各チューブに解凍したヒドロゲルを20マイクロリットル加え、気泡を避けるように注意して小島を静かに再中断します。均質な懸濁液が得られたら、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、1本のチューブから小水ゲル混合物全体を慎重にポケットに送り込みます。ヒドロゲルが完全に固まったら、移植部位に20マイクロリットルのセファロスポリンを加え、筋肉と皮膚を5-0連続外科的縫合で閉じる。
その後、完全な債務まで監視と熱パッド上のきれいなケージに受信者を配置します。マウスの小便処理が実証された後、分離されたマウス小子は移植のために十分に純粋になります。移植には生存率の高い孤立した島のみを使用する必要があります。
ヒドロゲルとの小葉移植片の完全な混合の後、移植片はISWAT部位に移植することができる。ISWATへの移植の約1ヶ月後、杯は、レシピエントマウスの体重が徐々に増加しながら、逆高血糖を移植する。移植後100日で、移植片の除去は10:00 a.mの即時増加をもたらす。
非空腹時血糖値.この時点での組織学的分析は、小地移植片がそのまま残っていることを明らかにする。インスリンおよびグルカゴン免疫蛍光染色とは、移植後100日で移植された小島も機能していることを示している。
あまりにも堅牢に、または取得した膵島の能力が損なわれるように、多用膵臓細胞を振り回さないように注意してください。孤立した小島は、部位での皮下白脂肪組織への単離された移植の効果を比較するコントロールとして腎カプセルの下に移植することができる。この手順は、肝臓以外の他の部位に小口移植の臨床試験の開始を追加します。.
