Целью данного исследования является изучение последствий засухи для сельского хозяйства. По мере того, как климат продолжает меняться, усиливается засуха, а засуха влияет на продовольственную безопасность. Метаболомика важна для определения и количественной оценки воздействия засухи на нашу пищу.
Большой проблемой в метаболомике является достижение высокого уровня достоверности идентифицированных соединений. Используя метоксиамин вместо гидроксиламина на стадии оксимации, мы повысили эффективность последующей стадии силилирования, поскольку метоксигруппа не реагирует с MSTFA. Современные методы наблюдения за реакцией растений на стресс окружающей среды сосредоточены на конкретных процессах или тканях.
В то время как этот метод является более интегративным за счет обнаружения химических сигналов в конечном зерновом продукте. В будущем мы хотели бы использовать этот метод, чтобы понять, как засуха и совмещение культур влияют на ячмень. Ячмень является важным зерном для продовольственной безопасности, и мы хотим понять, как на него повлияет изменение климата.
Для начала загрузите 200 миллиграммов ячменной муки в резервуар для твердофазной экстракции или SPE. Замочите муку с 200 микролитрами метанола на 20 минут для мацерации. Удалите метанол путем выпаривания под вакуумом в течение 30 минут.
После высыхания прикрепите колонку к вакуумному коллектору. Извлеките неполярные компоненты фракции А с дихлорметаном в флакон объемом 10 миллилитров, и запустите вакуумный коллектор до тех пор, пока мука не высохнет. Далее добавьте смесь метанола и деионизированной воды для извлечения полярных компонентов фракции В в флакон объемом 10 миллилитров.
Запустите вакуумный коллектор до тех пор, пока мука не высохнет. Добавьте стандарт 1 и стандарт 2 к фракции А и перемешайте путем повторного пипетирования. Полностью испарить растворитель при пониженном давлении с помощью ротационного испарителя.
Затем повторно растворите образец в метил-трет-бутиловом эфире, или МТБЭ, перед тем как добавить метанол и метоксид натрия в флакон. Дайте продолжить переэтерификацию в течение 90 минут при комнатной температуре при магнитном перемешивании. Добавьте в раствор водную соляную кислоту.
Смешайте подкисленный раствор с дихлорметаном. Соберите содержимое флакона с помощью длинной пастеровской пипетки и дайте фазам разделиться в пипетке. Промойте органическую фазу, добавив водную соляную кислоту.
Снова соберите содержимое флакона с помощью длинной пастеровской пипетки и дайте фазам разделиться в пипетке. Перенесите низшую органическую фазу в новый флакон и выпарите до сухости с помощью ротационного испарителя. Далее добавьте безводный сульфат натрия в колонку SPE.
Растворите испарившийся образец в дихлорметане и загрузите его на колонну SPE. Разбавьте фракцию 1 с тремя порциями н-гексана и МТБЭ в флакон объемом 10 миллилитров. Раствор, содержащий фракцию 1, выпарить до сухости на ротационном испарителе.
Повторно растворите образец в н-гексане и перенесите его во флакон автосамплера для ГХ/МС. Далее элюируют предварительную фракцию 2 из колонки SPE с тремя последующими порциями н-гексана и МТБЭ в флакон объемом 10 миллилитров. После выпаривания предварительной фракции 2 до сухости повторно растворите ее в безводном пиридине и добавьте МСТФА.
С помощью стяжек закрепите нитроперчатку на конце шприца со снятым поршнем. Наполните баллон безводным аргоном и приложите к шприцу одноразовую иглу. Протолкните баллонный шприц через перегородку флакона, содержащего безводный реагент, и вставьте второй шприц с длинной иглой, чтобы набрать растворитель.
Промойте флакон с образцом слабой струей безводного аргона. Запечатав флакон парапленкой, поместите его в масляную ванну с температурой 70 градусов Цельсия на 15 минут. После силилирования охладите фракцию 2 при комнатной температуре в течение пяти минут и загрузите ее в флакон автосамплера.
Добавьте стандарты 3 и 4 к фракции В и перемешайте путем повторного пипетирования. Перелейте два и четыре миллилитра смеси фракции B в новый флакон для переработки во фракцию 3 и фракцию 4 соответственно. Выпарить предварительную фракцию 3 до сухости на ротационном испарителе с последующим совместным выпариванием с безводным пиридином.
Растворите предварительную фракцию 3 в безводном пиридине и добавьте триметилсилимидазол. Промойте флакон с образцом слабой струей безводного аргона. После запечатывания флакона с образцом парапленкой нагрейте в течение 20 минут в масляной бане при температуре 70 градусов Цельсия.
После остывания раствора до комнатной температуры добавьте н-гексан и деионизированную воду. Перемешайте смесь и перенесите верхнюю органическую фазу во флакон автосамплера с помощью длинной пастеровской пипетки. Выпарить предварительную фракцию 4 до высыхания на ротационном испарителе с последующим совместным выпариванием с безводным пиридином.
Повторно растворите образец в безводном пиридине и добавьте метоксиламингидрохлорид. После промывки флакона безводным аргоном, оксаматировать парапленочный флакон в течение 30 минут в масляной ванне с температурой 70 градусов Цельсия. Как только флакон остынет до комнатной температуры, добавьте MSTFA и силайте в течение 20 минут на масляной бане.
Далее добавьте в флакон н-гексан и деионизированную воду и соберите нижнюю водную фазу с помощью длинной пастеровской пипетки. После последней промывки выпарить водную фазу до полного высыхания с помощью ротационного испарителя с последующим совместным выпариванием оставшегося материала с безводным ацетонитрилом. Повторно растворите образец в безводном ацетонитриле и MSTFA.
После промывки флакона безводным аргоном, нагрейте запечатанный флакон в течение 60 минут в масляной бане при температуре 70 градусов Цельсия. Загрузка образцов в ГХ/МС с использованием заданных объемов впрыска. Прогоните образцы с разделенным потоком гелия 14 миллилитров в минуту при температуре впрыска 250 градусов Цельсия.
Для фракций 1 и 2 повышайте температуру столба от 100 до 300 градусов Цельсия со скоростью 4 градуса Цельсия в минуту. После достижения 300 градусов по Цельсию подержите температуру в течение 10 минут. Для фракции 3 нагрейте и удерживайте колонну при температуре 300 градусов Цельсия в течение всего прогона.
Для фракции 4 увеличьте температуру в столбе от 70 до 142 градусов Цельсия со скоростью 2,5 градуса Цельсия в минуту. Держите температуру на уровне 142 градуса Цельсия в течение 10 минут. Затем увеличьте температуру со 142 до 235 градусов Цельсия на 4 градуса Цельсия в минуту, выдерживая 10 минут.
Наконец, выпекаем колонну при температуре 320 градусов Цельсия в течение 8 минут.
