Общая цель этого метода заключается в анализе влияния лечения стресса на бактериальные клетки, как на одной клетке, так и на уровне населения. Он обеспечивает глобальное видение влияния стресса на несколько аспектов роста бактерий, включая жизнеспособность клеток, морфологию и содержание ДНК. Это также позволяет охарактеризовать восстановление населения.
Этот метод может быть использован в фармацевтической промышленности для проверки активности новой молекулы противомикробных препаратов и оценить их влияние на жизнеспособность и рост бактерий. Стресс-индуцирующего лечения имеет неэффективность, такие как доза и зависит от времени. Возможно, необходимо провести предварительные тесты, чтобы определить оптимальную дозу и продолжительность лечения до начала этого протокола.
Визуальная демонстрация этого метода позволяет изнять важные детали каждого важного шага и как выполнить их должным образом. Для начала, привить пять миллилитров MOPS E'Rich Defined Medium с одной колонией E.Coli MG1655 HU-PAmCherry и расти при 37 градусах по Цельсию с встряхивания на 140 вращений в минуту на ночь. На следующее утро извлечь 100 микролитров образца и разбавить его 900 микролитров среднего для измерения оптической плотности на 600 нанометров.
Затем разбавьте культуру в пробирку, содержащую свежую среду до OD600 нанометров 0,01. Инкубировать привитую пробирку при 37 градусах по Цельсию при тряске при 140 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,2, что соответствует полной экспоненциальной фазе в богатой среде. Затем, aliquot образцы культуры для покадровой микроскопии изображения, разбавления и покрытия анализа, анализ цитометрии потока, и микроскопии снимок изображения.
Выставить оставшиеся 4,4 миллилитров клеточной культуры в пробирке для специфического лечения стресса. Например, 4,4 микролитера цефалексина по пять микрограмм на миллилитр и инкубируют при 37 градусах Цельсия при тряске при 140 об/мин. Подготовка десятикратных серийных разбавлений, до 10 до минус седьмой, из 200 микролитров образца культуры в свежей среде.
Смешайте между каждым разбавлением, очень нежным вихрем или инвертированием трубки. Плита 100 микролитров соответствующего разбавления на не отобранных пластинах LB агарозы и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день подсчитайте количество колоний, чтобы определить концентрацию жизнеспособных клеток в каждом образце культуры.
Участок CFU на миллилитр, как функция времени для необработанных и обработанных клеточных культур. Измерьте OD600 культуры на спектрофотометре. Разбавить образец культуры свежей средой при четырех градусах по Цельсию, чтобы получить образец с OD600 на уровне 0,06, что соответствует примерно 15 000 клеток на микролитер.
Для окрашивания ДНК смешайте разбавленный бактериальный образец с раствором 10 микрограмм на миллилитр флуоресцентного красителя в объемном рационе один к одному и инкубировать в темноте в течение 15 минут. Перед инъекцией образца смешайте образец очень нежным вихрем или инвертированием трубки. Перевечь образец в цитометр потока со скоростью потока около 120 000 клеток в минуту.
Приобретайте рассеянный вперед и рассеянный по стороне свет, а также флуоресцентный краситель/флуоресцентный сигнал ДНК с соответствующими настройками. Участок вперед рассеянной плотности клеток гистограммы для представления распределения размера клетки и участок ДНК флуоресцентный краситель / флуоресцентные сигнальные клетки плотности гистограммы для представления содержания ДНК в популяции клеток. Во-первых, разогреть термостатированную камеру микроскопа при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы стабилизировать температуру.
Подготовь слайды, установленные на агарозе, как описано в рукописи. Поместите слайд на сцену микроскопа и выполните получение изображения с помощью передаваемого света с целью контрастности лица и с возбуждением источника света на 560 нанометров для mCherry. Выберите поля зрения, содержащие изолированные ячейки, чтобы облегчить автоматическое обнаружение ячеек во время анализа изображений.
Убедитесь, что по крайней мере 300 клеток изображены, чтобы обеспечить надежный статистический анализ популяции клеток. Во-первых, удалить решение сохранения из микрофлюидной пластины и заменить его свежей среде разогретой до 37 градусов по Цельсию, как описано в Microfluidic Software User Guide. Прикрепите микрофлюидную пластину к многообразной системе.
А в микрофлюидном программном обеспечении нажмите на кнопку Seal, чтобы запечатать на пластине многообразную систему. После этого нажмите на кнопку Priming. Распогрейте микрофлюидную пластину с многообразной системой на стадии микроскопа и разогрейте при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы избежать расширения микрофлюидной камеры.
Запечатайте микрофлюидную пластину на микрофлюидной системе, нажав на кнопку Seal Off. Замените среду из восьми хорошо с 150 микролитров образца культуры и заменить средний от одного до пяти с желаемой среде, с или без стресс-индуцирующих реагент. Печать микрофлюидной пластины и поместите его на стадии микроскопа.
В микрофлюидной программе запустите процедуру загрузки клеток. Убедитесь, что загрузка клеток является удовлетворительным, глядя под микроскопом в передаваемом свете. Тщательно сосредоточьтесь в режиме передаваемого света и выберите несколько полей зрения, которые показывают изолированные бактерии и не переполнены, около 10 до 20 клеток на 100 квадратных микролитров.
В микрофлюидного программного обеспечения, нажмите на кнопку Run пользовательской последовательности, а затем запрограммировать инъекцию стресса вызывающих среды в течение 10 минут на двух PSI, а затем инъекции в одном PSI в течение длительного времени лечения стресса. Выполняйте микроскопию в замедленном режиме с одним кадром каждые 10 минут, используя фазовую контрастность в передаваемом свете и 560 нанометровый источник света для сигнала mCherry, если это необходимо. Запустите приобретение микроскопического изображения и протокол микрофлюидной инъекции одновременно.
Откройте программное обеспечение Фиджи и плагин MicrobeJ. Для анализа снимков опустите все изображения, соответствующие одному микроскопу, в бар загрузки MicrobeJ, чтобы сокатить изображения и сохранить полученный файл стеков изображений. Для данных замедленного действия просто опустите стек изображения в планку загрузки MicrobeJ.
Запустите автоматизированное обнаружение контуров клетки на основе сегментации фазового контрастного изображения и запустите обнаружение нуклеоидов на основе сегментации окрашенного флуоресцентного сигнала ДНК. Проверьте точность визуального обнаружения ячейки и при необходимости используйте инструмент редактирования MicrobeJ для коррекции. Сохранить полученный файл результата.
Нажмите на значок ResultJ, чтобы завершить анализ и получить окно ResultJ. Генерируется множество различных типов выходных графиков. Участок нормализованных гистограмм формы клетки или длины и среднего нуклеоидного числа на клетку.
Это исследование проанализировало поведение клеток Escherichia coli K-12 во время переходного воздействия цефалексина, антибиотика, который специально подавляет деление клеток. Клеточные культуры, растущие в присутствии цефалексина, проявляли аналогичные увеличения OD600 по мере того, как неподготовляемые культуры. Концентрация жизнеспособных клеток не возрастала при присутствуют цефалексин.
Клетки начали делиться снова, когда цефалексин был удален и в конечном итоге достигли концентрации, эквивалентной неподступной культуре через два часа. Различные напряжения привели к различным разгермевания OD и CFU на миллилитр кривых, в зависимости от эффекта индуцированных. Воздействие цефалексина спровоцировало параллельное увеличение размера клеток и содержания ДНК.
Когда цефалексин был удален, размер клеток популяции и содержание ДНК постепенно уменьшались и стали похожи на неподдерживаемую популяцию через два часа. Цефалексин спровоцировал образование длинных клеток с нормальной шириной клеток, тогда не было деления септы. Количественный анализ изображений подтвердил увеличение размера клетки и содержания ДНК.
Покадровые изображения подтверждают, что удлинение клеток и репликация хромосом и сегрегация не были ингибированы воздействием цефалексина. Анализ линии нитей клеток показал, что деление клеток возобновилось примерно через 20 минут после смывания препарата. Очень важно, чтобы убедиться, что бактериальная популяция находится в полном экспоненциальном росте, прежде чем вызывать стресс лечения.
Стресс-индуцирующего лечения, используемого для этих подходов может быть опасным для экспериментальных, как генотоксические соединения. Так обрабатывать соединения тщательно и носить перчатки, маски, очки, и лабораторные пальто.
