Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove

Временное изображение бактериальных роев и коллективный стресс ответ

Транскрипт

Этот протокол может быть использован для производства замедленной фильмы Pseudomonas aeruginosa роятся и захватить отталкивание роя бактериофагом или антибиотиками. Фильмы замедленного действия фиксируют детальную динамику кишащих ответ на антибиотики и бактериофаг, а техника требует только обезвоживания, компьютера, инкубатора и сканера документов. Для подготовки роятся агар пластины для P.aeruginosa роятся промежуток времени изображения, используйте 25 миллилитров пипетки, чтобы добавить 20 миллилитров роятся агар решение каждого экспериментального 10 сантиметров диаметром Петри блюдо.

Поместите пластины в один стек с крышками в течение одного часа при комнатной температуре. Включите обезвоживание, чтобы уменьшить относительную влажность в помещении до 40-50%Когда агар затвердеет, высушите роятся агар пластины в течение дополнительных 30 минут в ламинарном капюшоне потока с крышками и лицом вверх на 300 кубических футов в минуту с 40-50% относительной влажности при комнатной температуре. Затем храните высушенные роятся агар пластины при четырех градусах по Цельсию на срок до 24 часов.

Для роятся агар покрытие, провести P20 пипетки отзыв загружен с пятью микролитров от ночи P.aeruginosa культуры на 10-45 градусов угол 2-1/2 сантиметров выше центра одной роятся пластины и угнетать поршень до первой остановки касаясь агара только с жидким падением. Используйте шаблон, чтобы располагать пятно последовательно через различные роятся агар пластин. Чтобы пластины фаг инфекции, сначала смешать 30 микролитров ночь культурных P.aeruginosa с шестью микролитров один раз от 10 до 12 бляшек формирования единиц на миллилитр фага DMS3 vir и сразу же добавить шесть микролитров P.aeruginosa фаговой смеси на шесть равномерных спутниковых позиций на 2,8 сантиметра радиус концентрического круга, как попродемонстрировано.

Используйте шаблон, чтобы располагать пятно последовательно через различные роятся агар пластин. Чтобы пластины лечения антибиотиками, смешать 30 микролитров ночь культурных P.aeruginosa с соответствующей концентрацией и объемом антибиотика интерес и сразу же добавить шесть микролитров антибиотиков обработанных бактерий на шесть равномерных спутниковых позиций на 2,8 сантиметра радиус концентрического круга о центре блюда. Используйте шаблон, чтобы располагать пятно последовательно через различные роятся агар пластин.

Когда все культуры были покроеные, заменить четкие крышки чашки Петри с заказными черными крышками. Тщательно поместите роятся агар пластины на сканер в инкубаторе установлен на 37 градусов по Цельсию с 10 литровой водяной бане для поддержания влажности на 75%После размещения пластин в сканер, открыть файл и сохранить настройки, чтобы установить путь экономии для изображений и нажмите сканирования и OK с 30-минутными интервалами. Чтобы автоматизировать получение изображения, используйте программное обеспечение для сценариев.

Выберите как простое сканирование, так и одно сканирование и правое нажатие на простое сканирование, а затем левое нажатие на включенное. В конце инкубации импортируют все отсканированные изображения в ImageJ. В окне вариантов последовательности количество изображений указывает количество выбранных изображений.

Продолжайте начинать изображение на одном, чтобы начать с первого изображения в папке и масштаб изображения на 100%, чтобы сохранить первоначальный размер изображений. Нажмите скрытый RGB, чтобы сохранить изображения в цвете. Оставьте использовать виртуальный стек беспрепятственно и нажмите OK для загрузки изображений.

Нажмите файл, сохраните как и AVI, чтобы объединить изображения в файл AVI. Отрегулируйте сжатие до JPEG и частоту кадров до пяти кадров в секунду. Затем сохраните промежуток времени AVI в соответствующей папке хранения.

Промежуток времени изображения одной колонии дикого типа P.aeruginosa из пластины LB агар в бульоне LB ночь на 37 градусов по Цельсию и заметили в центре роятся агар пластины показывает первоначальный рост в виде колонии в центре пластины, которая распространяется в усики радиально из колонии. Рои перемещаются от центра роятся агар пластины на периферию и отталкиваются от сигнала стресса, испускаемого бактериями, которые были инфицированы фагами или лечение гентамицином. Фаге или гентамыцин, замеченные в одиночку на спутниковых позициях, не вызывают кишащих популяций, чтобы избежать этих областей.

Используйте 25 миллилитров пипетки для обеспечения того, чтобы роятся агар пластины содержат ровно 20 миллилитров. Важно также настроить время сушки пластин в соответствии с лабораторной средой. Наша методика позволяет нам визуализировать общие кишащих моделей популяций Pseudomonas aeruginosa.

Следующая цель состоит в том, чтобы контролировать индивидуальную подвижность клеток с помощью микроскопии Брайтфилда.

Мы подробно простой метод для производства высокого разрешения замедленного фильмов Pseudomonas aeruginosa стаи, которые реагируют на бактериофаг (фаг) и антибиотик стресс с помощью планшетного сканера документов. Эта процедура является быстрым и простым методом мониторинга динамики рояии и может быть адаптирована для изучения подвижности и роста других видов бактерий.

Смотреть дополнительные видео

Главы в этом видео

0:04

Introduction

0:36

Swarming Agar Plate Preparation

1:32

P. aeruginosa Growth and Plating

3:30

Time-Lapse Image Acquisition and Swarm Repulsion Measurement

4:55

Results: Representative Time-lapse Swarming and Collective Stress Response Imaging

5:42

Conclusion

Похожие видео

article

06:12

Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии

8.4K Views

article

12:21

Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

14.0K Views

article

08:21

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

16.9K Views

article

10:31

Многоцветный Покадровый изображений трансгенных данио рерио: Визуализация сетчатки стволовых клеток, активированных нейронов Целевые абляция сотовый

16.3K Views

article

07:58

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

17.8K Views

article

07:27

Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

16.7K Views

article

12:01

Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время

13.7K Views

article

08:47

Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела

11.7K Views

article

10:25

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

11.0K Views

article

07:52

Универсальный метод для монтажа Arabidopsis оставляет для прижизненной покадровой изображений

8.1K Views

Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.

Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.

Подробнее