Наш протокол оптимизирован для мышиной модели и использует материалы, которые легко доступны для всех исследователей. Этот метод может быть применен к здоровым, болезни, или генетически измененные модели мыши. Наш протокол позволит следователям ответить на любые вопросы о сердечной перицитной биологии от любой мышиной модели заболевания или генетической вариации.
Эта процедура даст представление о сердечной перицит биологии и поможет нам понять их вклад в сердечный гомеостаз и гемодинамику как в области здравоохранения, так и болезни. Поместите анестезированую мышь в положение на спине и заклеите ее конечности скотчем. Аккуратно откройте грудную полость и с помощью 25-го калибра иглы-бабочки можете жеть нисходящую аорту.
Сделайте ник в правом атриуме. Затем, perfuse сердце, по крайней мере 20 миллилитров 250 единиц на миллилитр гепаринизированных, кальция магния свободных фосфатов Dulbecco буферизированных солевой раствор на два миллилитров в минуту с переменным потоком перисталитического насоса. Perfusion является полным, когда чистый PBS выходит из правой атрии.
Вырежьте сердце на аорте, и поместите его в ледяной кальций-магний-бесплатно DPBS. Затем перенесите сердце в чашку Петри 15 на 15 сантиметров. Разрежьте сердце на мелкие кусочки с помощью весенних ножниц и тонкой точки типсов с достаточным ферментного раствора для покрытия частей.
Теперь перенесите кусочки и раствор в 50-миллилитровую коническую трубку и запечатав парафиновой пластиковой пленкой. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на орбитальном шейкере при 120 об/мин в течение 75 минут. После переваривания коллагеназы с ферментным раствором, декант жидкости через 100-микрон-клеточный ситечко в новую 50-миллилитровую трубку, оставляя достаточно раствора, чтобы куски не высохли.
Используя точечные миппы, возьмите ткань из трубки и поместите несколько кусочков на слайд микроскопа. Затем измельчите ткань между двумя слайдами микроскопа, чтобы разбить ткань. Промыть слайды с ферментом свободной культуры средств массовой информации в новую 50-миллилитровую коническую трубку.
Повторите этот шаг до тех пор, пока все части ткани не будут разобщены. Объедините натянутый раствор и ткани заземления в одну трубку. Процедить полученную подвеску через 100-микрон-клеточный ситечко в новую 50-миллилитровую коническую трубку.
Центрифуга образца в 220 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать от предыдущего решения, и осторожно повторно клеточной гранулы в холодном facS окрашивания буфера, содержащего DPBS и бычьей сыворотки альбумин. Подсчитайте ячейки и проверьте жизнеспособность с помощью счетчика ячейки.
Разбавить клетки до одного миллиона клеток на миллилитр с холодным facS окрашивания буфера, содержащего DPBS и бычьей сыворотки альбумин. Клетки теперь готовы быть окрашены и отсортированы. Подготовка и маркировка пятими миллилитров FACS труб для всех элементов управления и образцов клеток.
Aliquot один миллилитр клеток на трубку для необлященного образца, флуоресценция минус один элемент управления, и изотип-соответствует контроля. Используйте оставшиеся ячейки для сортировки. Все элементы управления и образцы могут быть подготовлены и окрашены в то же время.
Кроме того, подготовить и этикетки пятими миллилитров FACS труб в общей сложности девять компенсации контроля, два вида необлищенных бусин плюс семь различных фторхромов от маркерной панели. Для оптимизации контроля компенсации флуоресценции добавьте одну каплю компенсационных бусинок из флакона сжатия в каждую трубку. Затем добавьте один микролитер антител к бисеру.
Повторите для каждого антитела от панели маркера. Используйте элементы управления FMO для оптимизации фонового окрашивания из-за спектрального перекрытия. К клеткам в трубках управления FMO, добавьте все антитела от панели маркера на разбавлении от одного до 100, но исключите одно антитело.
Повторите для каждого антитела в общей сложности семь элементов управления. Используйте изотип-соответствует контрольные антитела для неспецифического окрашивания. К клеткам в изотип-соединенных маркировании трубок, добавьте isotype-соединенное антитело управления на разбавлении от одного до 100.
Затем подготовьте клетки к сортировке. К свежеисположенным клеткам добавьте коктейль антител при разбавлении от одного до 100. Кроме того, добавить краситель жизнеспособности клеток при разбавлении от одного до 1000.
Энергично смешивайте контроль компенсации путем вихревого импульса. Инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света, за исключением клеточной жизнеспособности бисера, который можно оставить при комнатной температуре, защищенной от света. Аккуратно смешайте элементы управления FMO, элементы управления, которые соответствуют изотипу, и клетки, которые будут отсортированы по вихрю импульса.
Инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. Добавьте три миллилитров буфера окрашивания FACS в каждый контроль компенсации, контроль FMO и контроль изотипа. Центрифуга труб при 300 раз g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Аспирировать от раствора, и повторно каждого гранулы в 400 микролитров FACS окрашивания буфера. Контроль компенсации, контроль FMO и элементы управления изотипом теперь готовы к использованию. После окрашивания, мыть клетки с FACS окрашивания буфера центрифугации в 300 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
Аспирировать раствор и повторно использовать клеточные гранулы в буфере окрашивания FACS до 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Использование новых facS трубки, которые имеют 35-микрон фильтр вершины, пипетки окрашенных образцов клеток на крышках и гравитации фильтрат для получения одноклеточных суспензий. Держись на льду.
Используйте сортер клеток для очистки клеток. Запустите необличные ячейки на сортере ячейки, чтобы установить напряжение и исправить для фонового сигнала. Вы запустите каждый одноцветный компенсационный образец шарика по одному, чтобы регулировать напряжение для каждого канала и регулировать ворота для положительного сигнала.
Сбор данных. Используйте программное обеспечение для расчета спектрального перекрытия путем расчета матрицы компенсации. Все напряжения готовы и установлены.
Вы запустите каждый изотип управления по одному. Эти данные могут быть использованы для регулировки ворот для неспецифического связывания, если таковые имеются. Вы запустите каждый образец FMO по одному.
Отрегулируйте напряжение для каждого канала, чтобы исправить спектральное кровотечение через из-за многоцветной панели. Вы запустите образцы окрашенных клеток в сортаторе клеток. Соберите клетки в 10-миллилитровых ферментов свободной культуры средств массовой информации в 15-миллилитровой конической трубки сбора.
Используйте следующую стратегию закрытого использования. Во-первых, ворота для одиночных ячеек. Затем ворота для живых клеток.
Далее, ворота для CD45-отрицательных ячеек. Ворота для CD34 и CD31-отрицательных ячеек. Затем ворота для NG2-положительных ячеек.
И, наконец, ворота для CD146 и CD140b-положительных ячеек. Для культуры перицитов, семена свежеприготовленных клеток в фермент-свободной культуры средств массовой информации на покрытием 24-хорошо пластины. Культура клетки в клеточном инкубаторе установлен на 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа, и 95%кислорода.
После энзиматической пищеварения и диссоциации всего сердца и до очистки FACS клеток, клетки сырой смеси, которые содержат много различных типов клеток от сердца. После очистки и культивирования FACS клетки однородны. Они одноядерные, довольно плоские, и имеют типичную перицитовую ромбоидную морфологию.
Используя FACS, клетки очищаются от однородности. Во-первых, мусор и дублеты были закрыты на основе распределения вперед и стороны рассеяния. Затем, мертвые клетки были закрыты из-за их реакции амина с красителем, который производит сигнал больше и интенсивнее, чем живые клетки.
Из живых клеток, гематопоэтические клетки были закрыты, будучи CD45-положительным. Для дальнейшего удаления гематопоэтических и эндотелиальных клеток были закрыты CD34-положительные и CD31-положительные клетки. Наконец, NG2-положительные и CD140b/CD146-положительные клетки были отобраны для того, чтобы быть периваскулярными клетками с выражением типичных перицитовых маркеров.
По сравнению с перицитами человеческого мозга, клетки имели аналогичную морфологию. По сравнению с мышью и человека гладкие мышечные клетки, клетки имели различные морфологии фенотипической характеристики клеток при прохождении семь иммуноцитохимии для перицитных маркеров показали никаких наблюдаемых изменений в морфологии или маркер выражения. Аналогичным образом, анализ цитометрии потока перицитов при прохождении семи подтвердил, что популяция остается однородной.
Жизнеспособность клеток имеет решающее значение для получения хорошей урожайности. Держите ткани холодной во время закупок, и держать клетки холодными во время окрашивания клеток. Кроме того, убедитесь, что энзиматические решения готовятся свежие каждый раз.
Для обеспечения изоляции правильных клеток после культивирования, характеризуют их с потоком цитометрии и иммунофлуоресцентного окрашивания. Эти клетки могут быть использованы в кокультурных экспериментах с эндотелиальными клетками для функциональных барьерных исследований, а также анализов для изучения их биологической и физиологической функции и характеристик. Сердечные перициты играют основополагающую роль в целостности и стабильности сосудов, и их дисфункция имеет последствия для глобальной сердечной функции.
С помощью нашей техники исследователи могут исследовать терапевтический потенциал сердечных перицитов.
