Здесь мы представляем протоколы для культивирования костных клеток на адаптируемой платформе lab-on-a-chip. Эти методы могут быть использованы для дальнейшего нашего понимания механизмов, которые регулируют механически индуцированной ремоделирования костей. Наша система позволяет осуществлять долгосрочное культивирование костных клеток, что позволяет проводить прямую количественную оценку формирования костей и ресорбции в ответ на изменение механической погрузочной среды.
Использование этих основополагающих методов может привести к открытиям, которые распространяются на ряд связанных с костями вопросов, таких как остеопороз, заживление переломов и перипротетический остеолиз. Для создания хорошо и микроканального слоя, объединить PDMS преполимер и лечебный агент в соотношении 10 к одному в пластиковый стаканчик и энергично смешивать, а затем дегазаций полимера в течение 30 минут. Медленно налейте смесь на соответствующую предварительно вытехаемую маску.
Пусть он сидит в течение 30 минут и выпекать его при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 часов. Расслабьте края PDMS с конические лабораторные шпателем и тщательно очистить его от маски, а затем вырезать отдельные чипы скальпелем и 3D-печатный шаблон и поверхности очистить их с упаковочной лентой. Чтобы сделать мембранный слой PDMS, повторите предыдущие шаги для смешивания, заливки и выпечки PDMS.
Удалите лист PDMS из выравнивания коробки и вырезать отдельные мембраны, которые соответствуют размерам хорошо и микроканального слоя. Используйте калиперы для измерения толщины мембраны в центре и отказаться от любых мембран, которые находятся за пределами желаемой толщины, а затем тщательно очистить мембраны с упаковочной лентой и поместить их на кусок парафиновой пленки. Чтобы сделать слой крышки PDMS, повторите предыдущие шаги для смешивания, заливки и выпечки PDMS.
После резки отдельных крышей до размера, удар доступа отверстия через PDMS с одного миллиметра биопсии удар, а затем поверхность очистить их с упаковочной лентой. Активируйте поверхности слоев один и два с плазменным очистителем в течение 30 секунд на средней радиочастотной установке питания, затем выровнять отверстия доступа в слой один с микроканалами в слое два и твердо нажмите два слоя вместе. Для глубокого хорошо дизайн, повторить этот процесс со слоями два и три с помощью двусторонний ленты, чтобы прикрепить парафиновой пленки слоя три к плоской поверхности во время обработки плазмы.
Обрезать избыток материала из мембраны PDMS и тщательно очистить лист парафиновой пленки от нижней части чипа. Выпекать чип при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы увеличить прочность связи между слоями PDMS, а затем вставить угол дозирования советы в отверстия доступа в крышке и обеспечить их с двумя сторонами эпоксидной смолы с помощью микропипетта отзыв применять эпоксидной смолы вокруг каждого кончика. После того, как эпоксидная смола полностью вылечилась, поверхность очистить чип с 70% этанола и передать его в шкаф биобезопасности.
Подключите пятими миллилитровый шприц к диспенсаторным кончикам со стерильными силиконовыми трубками и заполните весь чип 70%-ным этанолом в течение по крайней мере 30 секунд. Удалите этанол из чипа и стерилизовать его с ультрафиолетовым светом на ночь. На следующий день, мыть чип три раза с дистиллированной водой, заполнить его водой, и удалить трубки из дозирования советы.
Инкубировать чип, по крайней мере 48 часов при 37 градусах по Цельсию. Поместите компрессионную пружину вокруг вала пластины и вставьте ее в центральное отверстие в нижней части основания, а затем прикрепите блок циферблата к нижней части основания четырьмя самонажатием винтов. Поместите вторую пружину сжатия вокруг центрального винта.
Вставьте винт в шестиугольное отверстие в нижней части циферблата и ввинчивайте сборку в резьбовое отверстие в центре блока циферблата. Винт четыре мужчины-женщины противостояния в нижней части базы. Удалите слабину с устройства, повернув циферблат против часовой стрелки до тех пор, пока верхняя часть пластины не будет ниже верхней части основания, затем медленно поверните циферблат по часовой стрелке, пока верхняя часть пластины не будет высовьться с верхней частью основания.
Используйте пятими миллилитровый шприц, чтобы удалить воду из глубокой чипа и покрыть дно колодец с 200 микролитров коллагена типа I в уксусной кислоте в течение часа. Промыть чип три раза с помощью DPBS с кальцием и магнием и поместить его в держатель чипа. Семя чип с MLO-Y4 остеоцитов в MEM альфа-среды дополняется икроножной сыворотки, FBS, и пенициллин / стрептомицин.
Удалите трубки из дозирования советы, поместите чип в глубокой хорошо культуры блюдо, и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа в течение 72 часов. После инкубации, приложите стерильные трубки для дозирования советы и использовать пять миллилитров шприц для удаления отраченной среды культуры из чипа, а затем медленно пополнить чип со свежей среде. Поместите держатель чипа в прямоугольную вставку в верхней части основания погрузочного устройства, кормите трубки через слоты, расположенные на крышке, и закрените крышку к основанию.
Нанесите нагрузку на ячейки, повернув циферблат по часовой стрелке до достижения желаемого смещения пластины, затем поместите погрузочное устройство в пустую коробку наконечника P1000 и инкубировать клетки с нагрузкой в течение 15 минут. После инкубации снимите нагрузку с ячеек, повернув циферблат против часовой стрелки в исходное исходное положение, затем снимите крышку с устройства, поместите держатель чипа в глубокой пластине культуры, и инкубировать клетки в течение 90-минутного периода восстановления нагрузки после. Используйте пятими миллилитровый шприц, чтобы удалить кондиционированную среду из чипа и удалить чип из держателя чипа, а затем использовать конические шпатель, чтобы разорвать связь между крышкой PDMS и хорошо слой.
Клетки теперь готовы к анализу. Неглубокая конфигурация может быть использована для анализа функциональной активности остеобластов и остеокластов. Формирование костей из преостеобластов было количественно с использованием красного ализарина и пятен фон Коссы.
Резорбция костей от остеокластов была количественно с помощью толуидина синий окрашивания и сканирования электронной микроскопии был использован для проверки наличия резорбции ямы. Конфигурация чипа глубокой хорошо использовалась для индуцирования механотрансдукции остеоцитов путем растяжения клеток через статическое из плоскости растяжения. Изображения остеоцитов, посеянных в чипсах, показывают, что 48-часовая инкубация чипа с дистиллированной водой имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток в типичной морфологии.
Во время приступов нагрузки остеоциты подвергались воздействию градиента штамма, индуцированного на мембране PDMS. Была определена взаимосвязь между средним эквивалентным штаммом и смещением пластин для значений от одного до двух миллиметров и была создана репрезентативная тепловая карта индуцированного штамма. После погрузки, жизнеспособность клеток была проанализирована с лактат дегидрогеназы окрашивания и приложения V и мертвых клеток анализа.
Лактат дегидрогеназа пятно растянутых остеоцитов показали более легкое окрашивание вблизи внешнего края хорошо, что соответствует расположению более высоких значений штамма. Наша платформа обеспечивает высокую степень универсальности и может быть использована для исследования различных факторов, которые регулируют ремоделирование костей, таких как нагрузка индуцированной механотрансдукции, воспаление, и лекарственные эффекты. Представленные здесь методы обеспечивают основу для разработки истинного костного органа на чипе, который может значительно улучшить наше понимание многоклеточных тонкостей, которые регулируют здоровье костей.
