ACE является оптимальной визуализации достопримечательностей. Он поддерживает, чтобы повторить его в долгосрочной визуализации in vivo островковых клеток для того, чтобы изучить их функцию и жизнеспособность в прививочных ситуации. Он также может быть расширен для изучения других аспектов при физиологических и патологических условиях в режиме реального времени.
Преимущество метода ACE заключается в том, что те же отдельные островки поджелудочной железы человека могут следовать неинвазивно с субклеточным разрешением в течение длительного периода времени. Показатели успешности заместительной терапии бета-клеток продолжают улучшаться. Тем не менее, оценка эффективности прививки островка и выживания in vivo, по-прежнему остается сложной задачей.
Этот метод может помочь оценить и оптимизировать результаты трансплантации островка. Такой подход не ограничивается только островками поджелудочной железы. Он также хорошо подходит для изучения тканей пострадавших.
Например, при диабетических осложнениях, таких как гломерули почек или кусочки печени, достаточно назвать несколько. Для начала поместите мышь на теплую грелку, поместите ее в держатель головы и навеяте на носовую маску. Используйте большой и указательный пальцы, чтобы поднять голову немного.
Закрепите его металлическими кусочками по бокам. Убедившись, что ухо куски исправить голову прямо под ушами. Подкожно ввести бупренорфин раствор в задней части мыши.
Аккуратно втягивайте веки глаза для пересадки с помощью тупых типсов. Поп глаз и свободно исправить его с парой пинцета покрыты полиэтиленовой трубки. После передачи век в чашку Петри с PBS, забрать примерно от 20 до 30 островков в глазной канюлярной.
Используя 25 калибровочных игл вверх, осторожно вставьте кончик в роговицу и сделайте один боковой разрез. Аккуратно поднимите роговицу с канюлей, предварительно нагруженной островками, и медленно отпустите островки в глаз. Медленно втягивать канюлю и наносить гель для глаз на глаз.
Через 10 минут снимите типсы, удерживая веко и поставь глаз обратно в нормальное положение. Для визуализации имплантированных человеческих островков с двумя фотонной микроскопией поместите платформу держателя головы под микроскопом и ввемите гель для глаз на глаз в качестве жидкости для погружения между роговицей и хрусталиком. Распоить глаз под объективом и изображением имплантированных человеческих островков, как описано в текстовой рукописи.
Чтобы удалить аутофторесценцию, перейдите на вкладку обработки изображений, выберите арифметику канала и ввемите первый канал минус второй канал. Это создает новый четвертый канал. Переименуй его васкулатурой.
Повторите этот процесс и ввех канала три минус канал два, чтобы создать новый канал пять и переименовать его помидор все. Для определения островка вручную создайте новую поверхность и выберите редактировать вручную в мастере. Держите указатель в избранном режиме и в 3D-представлении.
И нажмите громкость, чтобы визуализировать разделы. В вкладке чертежа выберите контур и нажмите рисовать, чтобы начать рисовать контуры вокруг границы островка, начиная с среза позиции один. Затем переместись в новое положение среза и повторите контуры рисования.
Закончите с последним ломтиком в верхней части островка и в конце, нажав на вкладку создать поверхность. Следующий сегмент, островок сосудов и островок томатной флуоресценции с использованием островка маски. Выберите ранее определенный объект маски островка, перейдите на вкладку редактирования и нажмите на маску всю вкладку, которая открывает новое окно.
Выберите канал vasculature в меню высадки выбора канала и активируйте параметры дубликата канала перед нанесением маски. Постоянный внутри, снаружи и установить voxels внешней поверхности до 0.000, который создает новый канал шесть. Переименовать этот канал островок сосудов.
Повторите предыдущие шаги и выберите помидор все в меню высадки выбора канала, чтобы создать новый канал, переименовать его, островок помидор. Затем создайте новую поверхность в меню сцены и выберите автоматическое творение в мастере. Установите исходный канал на ранее созданную островок васкулатуры и выберите фоновое вычитание.
Необязательно используйте фильтры. Например, выберите громкость и отрегулируйте фильтр в окне, который может удалить выбранные объекты службы. Закончите мастер и назовите новый объект поверхности, островок сосудов.
На островке объект васкулатуры перейдите на вкладку редактирования и нажмите на маску всей вкладки, которая открывает новое окно. Выберите островок томатный канал в меню высадки выбора канала и установите воксели снаружи поверхности до 10.000, что создает новый канал. Переименовать этот канал островок томатной сосуды.
Для сегментации томатной капсулы флуоресцентный сигнал выберите канал арифметики в вкладке обработки изображений и тип канала семь минус канал восемь создания нового канала. Переименуй его в томатную капсулу. Создайте новую поверхность, как описано ранее, и выберите исходные каналы, островок томатной сосудов или капсулу помидоров у мастера.
Затем выполните фоновое вычитание. Откройте островок backscatter файл и создать новую поверхность. В мастера, выбрать автоматическое создание и определить область интереса.
При необходимости отрегулируйте порог в абсолютной интенсивности. Поверхностный объект можно нажать или выключить, чтобы перепроверить с соответствующей интенсивностью канала. Когда закончите закрыть мастера.
Наконец, выполните количественную оценку, выберите созданный объект поверхности в меню сцены и перейдите на вкладку статистики. Чтобы получить подробные данные об объеме, выберите подробную вкладку и выберите конкретные значения и объем из меню высадки. Для получения общего значения объема перейдите на подробную вкладку и выберите средние значения.
Этот протокол был использован для трансплантации не помеченных человеческих островков во внутреннюю камеру глаза восьминедельной самки красных флуоресцентных мышей-реципиентов. Интерактивное программное обеспечение для визуализации затем использовалось для извлечения количественных данных из изображений. В vivo флуоресценции изображений, человеческий островок трансплантатов был скомпрометирован значительными помехами от аутофторесценции тканей, которые не наблюдались в мышах островок трансплантатов.
Для улучшения соотношения сигнала к шуму был вычтен канал аутофторесценции. Затем граница островка называется островок маска и соответствующие каналы были определены вручную. Наконец, для извлечения количественных данных использовалась сегментация томатного сигнала в сосуды век и капсулу век и окончательная визуализация поверхности.
Здесь в качестве репрезентативной продольной визуализации сеанса одного и того же человека островок трансплантата в течение двух недель, двух месяцев, пяти месяцев и восьми месяцев после трансплантации. Показаны изображения MIP первоначально записанных необработанных данных, обработанных изображений после удаления островка автофлуоресценции и сегментированных островковых объектов. При выполнении инъекции век, убедитесь, что для предварительной загрузки островков в небольшом объеме и использовать гибкие двойные легкие руки на стерео микроскоп, чтобы выделить пространство камеры глаза для того, чтобы успешно ввести островки в ACE.
После визуализации in vivo глаза могут быть исправлены и дополнительно исследованы для окрашивания антител и традиционной гистологии. Этот метод очень полезен для функциональных исследований отдельных островков человека в режиме реального времени и в физиологических условиях, особенно в контексте васкуляризации, жизнеспособности и метаболических исследований.
