Этот протокол описывает стабилизированную и повторяющуюся визуализацию поджелудочной железы in vivo на клеточном уровне с новым окном прижизальной визуализации поджелудочной железы. Основным преимуществом данной методики является то, что в поджелудочной железе живой мыши можно выполнять неподвижную, трехмерную визуализацию с разрешением до клеточного уровня в течение трех недель. Начните с подготовки хирургической платформы и дезинфекции поверхностей 70% этанолом.
После анестезии используйте ректальный зонд с гомеотермически контролируемой грелкой для контроля температуры тела. Удалите волосы с левого фланга мыши и нанесите спирт и йод альтернативно, вращаясь от места разреза к внешней поверхности, никогда не возвращаясь к месту разреза, и заканчивая йодом. Затем делают 1,5-сантиметровый разрез на левом боку мыши, рассекая кожу и мышцу.
Используйте черный или нейлоновый шов 4-0 для выполнения шва кошелька в разрезе разреза. Осторожно потяните селезенку кольцевыми щипцами и определите поджелудочную железу. Поставив окно по бокам мыши, пропустите селезенку и поджелудочную железу через открытое пространство окна.
Затем аккуратно поместите поджелудочную железу на пластину окна визуализации, поместив селезенку на открытое пространство окна. Вводят панклит панк-1 красного цвета непосредственно в поджелудочную железу. Используйте иглу катетера 31-го калибра для нанесения капель клея n-butyl cyanoacrylate на край окна визуализации, обеспечивая минимальное количество клея.
Аккуратно нанесите 12-миллиметровое круглое покровное стекло на край окна визуализации. Затем зажмите шовную петлю, чтобы она вписалась в боковую канавку окна и трижды завяжите ее. Наконец, чтобы предотвратить прерывание этих плотных швов, когда мыши бодрствуют, отрежьте максимальное проксимальное место галстука.
Начните с включения приживитого микроскопа, включая мощность лазера. Чтобы вставить сосудистый катетер, надавите на проксимальную сторону хвоста указательным и третьим пальцем. При необходимости обогреть хвост лампой.
Продезинфицируйте хвостовую вену с помощью 70%-ного этанолового спрея, затем вставьте катетер 30-го калибра в боковую хвостовую вену и визуализируйте срыгивание крови в трубке PE-10. Нанесите шелковую ленту на катетер, чтобы стабилизировать его. Впрыскивайте декстран FITC и декстран TMR или другие флуоресцентные зонды в зависимости от обстоятельств, в соответствии с комбинацией флуоресцентных зондов.
Вставьте ректальный зонд для автоматического контроля температуры тела с помощью системы гомеотермических грелок. Затем вставьте окно визуализации поджелудочной железы, подготовленное во время установки прижизальной микроскопии, в оконный держатель. Перенесите мышь с хирургической платформы на стадию визуализации.
Чтобы выполнить приживитую визуализацию, начните с визуализации поджелудочной железы с низким увеличением, например, в четыре раза, чтобы сканировать весь вид поджелудочной железы в окне визуализации поджелудочной железы. После того, как область интереса была определена, переключитесь на объектив с более высоким увеличением, например, в 20 или 40 раз, чтобы выполнить визуализацию на клеточном уровне с боковым и осевым разрешением примерно 0,5 микрометра и 3 микрометра соответственно. Выполняйте Z-стек или покадровую визуализацию для наблюдения за 3D-структурой или динамикой клеточного уровня, такой как миграция клеток.
Приживитая микроскопия в сочетании с окном визуализации прижизной поджелудочной железы обеспечивает долгосрочную стабильность тканей, что позволяет получать изображения с высоким разрешением для отслеживания отдельных островков в течение трех недель. Окно, имплантированное в черную мышь C57 6 N с внутривенно введенным анти-CD31 антителом, конъюгированным с флуорофором Alexa 647, облегчало широкоугольную визуализацию и увеличивало 3D-визуализацию поджелудочной железы. Ацинарные клетки были идентифицированы на усредненных изображениях ткани поджелудочной железы в соседней сосудистой клетке, визуализированных с использованием аутофлуоресценции и анти-CD31 антител соответственно.
Используя мозаичный метод визуализации, который сочетает в себе широкоугольный вид с изображением высокого разрешения, примерно от 40 до 50 островков с соседней сосудистой сетью были визуализированы в мыши MIP-GFP. Предыдущее исследование показало, что островки можно отслеживать в течение трех недель, используя этот стабильный метод визуализации. Для визуализации раковых клеток nuclite красные клетки PANC-1 были непосредственно имплантированы в поджелудочную железу мыши во время операции, а близлежащие сосуды были окрашены анти-CD31, конъюгированным с Alexa 647.
С помощью этого протокола были сгенерированы широкополые изображения рака поджелудочной железы. Это помогло очертить край опухоли, а также достичь 3D-изображений с высоким разрешением на уровне одной клетки. Наиболее важным шагом в этом методе является умелое имплантация окна визуализации поджелудочной железы в мышь.
Используя другие комбинации флуоресцентных клеток мыши и зондов антител, можно было идентифицировать динамическое взаимодействие близлежащих клеток с островками или отменными клетками. Этот метод может быть широко применен теми, кто исследует изменение островка в различных патофизиологических условиях и микросредах рака поджелудочной железы in situ.
