Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии о механизмах аутоиммунных заболеваний, иммунодефицита, центральной толерантности и интулации тимуса. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет в vivo продольной записи набора прародителя и зрелой Т-клеточной экгрессии в васкуляризированных и привитых сегментах тимуса мыши. Хотя этот метод может дать представление о развитии и функции тимуса, также может быть применен к другим тканям, таким как островки поджелудочной железы или гломерули почек.
Чтобы изолировать тимус, поместите мышь на стерильные абсорбентные бумажные полотенца в спинном вертикальном положении в капюшоне ламинарного потока и распылите и протрите живот мыши 70% этанола. Сделайте поверхностный V-образный разрез в нижней части живота, чтобы разоблачить грудную полость и использовать пару прямых 10-сантиметровых рассекающих ножниц, чтобы сделать разрез на 0,5-1 сантиметр в груди вдоль брюшной средней линии. Сложите кожу по обе стороны грудной клетки, чтобы разоблачить грудной полости и сделать два дополнительных глубже 0,5 до одного сантиметра боковых разрезов через диафрагму и грудную клетку для доступа к превосходной медиастинии в передней грудной полости.
Тимус должен выглядеть как две бледные доли прямо над сердцем. Поместите изогнутые force под тимус и потяните вертикально, чтобы извлечь полный орган, предотвращая складной задней части грудной клетки с парой прямых типсов. Затем погрузите изолированный тимус в стерильное 60-миллилитровое блюдо, содержащее холодный стерильный PBS на льду, и используйте скальпель, чтобы сократить соединительный перешеек, чтобы отделить тимические доли.
Перед трансплантацией пометите и взвесите каждую мышь-реципиент и поместите первое животное в боковое боковое лежачий положение с одним глазом, непосредственно подвергаемым воздействию объектива рассеченного микроскопа. Используя ножницы Vannas, акциз один из изолированных тимических долей до одного миллиметра в ширину после зигзагообразной картины, чтобы гарантировать, что каждый сегмент содержит некоторые тимической коры и ткани медуллы. Очень важно, чтобы обрезать тимус прямо перед имплантацией, как большие куски не могут engraft должным образом.
Далее, начиная с основания роговицы хирургической области, используйте кончик 40-миллиметровой 18-калибровой иглы, чтобы сделать небольшой разрез во внешние слои роговицы, так что кончик пары рассечения ножницы могут быть введены. Используйте ножницы, чтобы сделать от пяти до 10-миллиметровый разрез фланга непосредственно вокруг основания роговицы при использовании плоских типсов, чтобы твердо держать роговицу открытой, чтобы предотвратить повторное пропечатывание. Хватая вырезать эпителия роговицы с плоскими типсами, поддерживать отверстие в роговице при вставке тимического сегмента через отверстие.
Важно, чтобы вставить кусок тимуса быстро через отверстие роговицы, чтобы предотвратить спонтанное перепечатывание до введения ткани. Будьте осторожны, чтобы сохранить целостность тканей на этом этапе. Нажмите мягко на поверхность глаза, чтобы сдвинуть введенный сегмент ткани в боковое положение по отношению к зрачку, чтобы сохранить функцию глаза.
И использовать плоские типсы, чтобы нажать обе стороны роговицы открытия твердо друг против друга в течение трех-пяти секунд для содействия самопечати. Если пересадка должна быть выполнена на обоих глазах, поверните мышь на противоположную боковую сторону для второй имплантации, как только что продемонстрировано. Когда операция будет завершена, верните мышь в пустую клетку, предварительно разогретую тепловой лампой с мониторингом до полного лежачих мест.
В соответствующем экспериментальном времени, поместите анестезированной мыши получателя на фиксированной стадии микроскопа платформы в боковом боковом положении лежа на тепловой панели с одним глазом вверх. И вставьте голову мыши в стереотаксис держателя головы. Отрегулируйте ручку, чтобы сдержать голову мыши в боковом боковом положении, чтобы позволить прямой доступ микроскопа цели для глаз проведения трансплантата тимуса и оттянуть веки, удерживая глаз на роговице края с парой пинцет-советы покрыты полиэтиленовой трубки прилагается к UST-2 твердых универсальных суставов.
Добавьте несколько капель стерильного солевого раствора или искусственных разрывов между роговицей и хрусталиком, прежде чем поместить цель микроскопа 5X на глаз мыши и найти тимус в поле микроскопа. Затем переключитесь на цель погружения воды более высокого разрешения с большим рабочим расстоянием и выберите режим приобретения в программном обеспечении микроскопа. Запустите режим резонансного сканера и выберите режим визуализации XY'T.
Включите аргонный лазер и отрегулируйте мощность до 30% для возбуждения флуоресценции. Выберите соответствующую лазерную линию возбуждения и установите акусто-оптический пучок сплиттера для соответствующих длин волн выбросов, используя обнаружение отражения одновременно для обнаружения backscatter и разграничения структуры тканей. Соберите эмиссию на выбранной длине волны и установите разрешение пикселей 512 на 512.
Затем нажмите в прямом эфире, чтобы начать визуализацию, регулируя уровни усиления по мере необходимости. Сосредоточьтесь на верхней части тимического имплантата и выберите начать определять начало стека. Затем сосредоточьтесь на последней плоскости в имплантированном тимусе, который можно визуализировать, и выберите конец, чтобы определить конец стека, используя размер в пять микрометров.
Установите интервал времени для приобретения каждого стека в течение 1,5-двух секунд и выберите опцию приобретения до тех пор, пока не будет остановлена для непрерывного изображения. Затем нажмите кнопку начать инициализировать запись. Здесь показаны ярко-полевые и флуоресценционные изображения одной и той же области имплантата тимуса, которые могут служить для двойного макроскопического продолжения роста тканей и исследований инавертки и продолжения.
Ярко-полевой образ также облегчает визуализацию васкуляризации имплантированных тканей, позволяя с течением времени уникально изучать зависимость физиологии тимуса от кровоснабжения. Эта модель позволяет визуализировать трансмиграцию клеток из кровотока в имплантированный тимус, отслеживание контактов между GFP-положительными клетками-предшественниками, входящими в тимический имплантат с RFP-маркировкой резидентных тимических эпителиальных и стромальных клеток во время процессов дифференциации и отбора, а также мониторинг регрессивных иммунных клеток из тимуса в периферические кровеносные сосуды. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы свести к минимуму воздействие тканей для оптимального engraftment, а также ограничить размер разреза в глазу, чтобы невредимые иссечения фрагмента через роговицу при одновременном снижении фиброза во время заживления.
После этой процедуры, другие методы, такие как локализованное лечение контроля и разрез других тканей в контралатеральный глаз могут быть выполнены, с тем чтобы ответить на дополнительные вопросы о иммунных дисфункций, связанных с инфекциями, детерминанты и механизмы толерантности к трансплантации. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области иммунологии, чтобы исследовать развитие Т-клеток, в том числе прародителя набора, тимус-глаз динамики, и зрелые шаги регрессии Т-клеток in vivo.
