Цель этого протокола состоит в том, чтобы определить метод, который может быть использован для выявления новых генов, которые участвуют в сигнализации кальция. Для этого мы используем классический форвардный генетический экран. Сигнализация кальция является важным средством защитного реагирования в нескольких системах растений.
Для того, чтобы определить гены, участвующие в этом пути, мы использовали классический форвардный генетический экран. В этом методе, EMS будет использоваться в качестве алкилатного агента для введения случайных мутаций в системах растений. Разработанное поколение мутантов может быть использовано для скрининга на фенотип интереса.
После того, как фенотип интереса был определен, причинный ген может быть отображен. В этом исследовании мы используем модель растения Arabidopsis, который имеет кальций репортер aequorin в своем спектре. Взвесить 150 мг семян аекворина для EMS mutagenesis и еще 150 мг семян, которые будут использоваться в качестве контроля.
Перенесите семена в 50 мл соколиной трубки и добавьте 2%EMS или автоматическую воду. При использовании EMS, будьте осторожны, потому что это канцерогенные. Защитные шестерни следует носить при использовании EMS и любой вид разлива должны быть предотвращены.
Печать Сокол трубки с парафином и оберните его алюминиевой фольгой. Поверните конец трубки над концом в течение 18 часов при комнатной температуре. Разрешить семена, чтобы урегулировать и удалить раствор EMS тщательно и выбросить в мусорный контейнер, содержащий один моляр NaOH.
Вымойте мутагенизированные семена тщательно с 40 мл автоматической воды по крайней мере восемь раз. Для окончательной стирки добавьте 100 миллимолялар тиосульфат натрия и промойте по крайней мере три раза, чтобы удалить следы EMS. Замочите семена в 40 мл автоматической воды в течение одного часа, чтобы рассеять EMS из семян, а затем поместить их на бумаге Whatman до полного высыхания.
Перенесите семена в Эппендорф и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение двух-четырех дней для стратификации. Перенесите мутагенизированные семена и обработанные водой семена на почву и перенесите их в комнаты роста с 16-часовым светом и восьмичасовым темным фото периодом при 22 градусах Цельсия и 70% относительной влажности. Для того, чтобы определить, если мутагенез был успешным, искать хлорофилла сектора.
Мы использовали единый метод сбора семян на основе родословной, и каждому заводу М1 дается уникальный номер. После созревания семена собирают из этих отдельных растений-мутантов и хранятся в качестве отдельных линий M1. Используется высокая пропускная способность семян стерилизации и гидропонного протокола корня растений, адаптированные из Ranf и др.
В первый день поместите почти от 12 до 15 семян М2 на М1 одной линии в отдельных колодцах 24-хорошо ткани культуры пластины и стерилизовать с использованием гипохлорита натрия и раствора соляной кислоты в соотношении трех к одному. Это высвобождает газ хлора, который стерилизует семена. Оставьте пластину на ночь, чтобы полностью испарить оставшийся газ хлора.
После стерилизации добавьте полутвердые жидкие MS-средства массовой информации в отдельные скважины и расслоить семена в течение двух-четырех дней при четырех градусах по Цельсию, а затем переместим семена в камеру роста с фото периодом 10-часового света и 14-часовой темноты при 22 градусах Цельсия, 70% относительной влажности. На 14 день, как только саженцы от восьми до 12 дней, место 12 M2 саженцы от каждой линии индивидуально в 96-ну люминометр пластины. После передачи рассады добавьте 150 микролитров из пяти растворов микромолара Coelenterazine в отдельных скважинах и храните в темноте при 21 градусе по Цельсию в течение восьми часов.
Coelenterazine является протезной группой, которая связывается с апоэкворином для формирования функционального аэкворина. Coelenterazine является светочувствительным и, следовательно, хранится в темных бутылках, защищенных от света. На следующий день экранные мутанты используют перекись водорода в качестве стимула и измеряют последующую высоту кальция.
Для одновременного измерения 24 скважин, из автоматизированной кинетической программы, которая включает в себя измерение фона в течение одной минуты, а затем стимулом того и измерения в течение 10 минут, а затем разряда инъекции 150 микролитер и измерения в течение трех-пяти минут. И любой разряд для дочери aequorin будет включен в чтение для количественной оценки измеренного кальция и в качестве дополнительного контроля для функционального аекворина. Показания, представленные в вышеуказанной методике, в относительно легких единицах.
Для расчета цитозолической концентрации ионов кальция используется ранее описанное уравнение концентрации, данное Rental and Knight в 2004 году, которое описано в протоколе. РЛУ, полученные из люминометра, добавляются в уравнение для расчета концентрации ионов кальция. Полученные цитозолические значения ионов кальция затем графически построены против дикого типа контроля для выявления миокида водорода мутантов кальция ответ.
Это репрезентативный результат показанного протокола. Мы показали одну линию M1 с 12 отдельными саженцами, которые были измерены для повышения концентрации ионов кальция. Зеленая линия на графике указывает на аекворин дикого типа, который измерялся вместе с мутантами.
Красный цвет в среднем всех 12 саженцев, и черная линия отдельных саженцев M2 измеряется для высоты иона кальция. Сеянцы, показывающие значительно сниженную реакцию на применение перекиси водорода, затем спасаются. Спасенные мутанты затем подтверждаются в следующем поколении, а затем отображение для выявления причинных генов.
Предостережение следует проявлять при использовании EMS в качестве мутагена, так как это канцероген. Защитные передач следует носить в любое время и любой разлив сделано должно быть рассмотрено с хорошей лабораторной практики. Кроме того, при выполнении родословной основе сбора семян, отдельные растения должны быть собраны с особой осторожностью, так что нет смешивания каких-либо семян на любом этапе.
Это поможет вернуться назад и проследить материнское растение, которое является гомозиготным мутантным растением. Кроме того, поскольку этот метод не вносит каких-либо предубеждений или каких-либо предварительных предположений в метод скрининга, он может быть использован для одного или нескольких условий для определения фенотипа интереса. Кроме того, несколько независимых генов также могут быть идентифицированы с помощью одного и того же протокола.
Протокол прост в использовании, так как с небольшой дозировкой, огромное количество растений могут быть мутагенизированы. Эти огромные количества мутантных растений могут быть использованы для нескольких популяций и для нескольких условий и для выявления нескольких генов. Частичная потеря функции, измененная функция, полная потеря функции, а также составная функция гена могут быть определены с помощью этого метода.
Картирование должно быть легкой задачей, учитывая развитие картографических технологий в текущих сценариях. Де Ново основе картографической системы, SNP основе расового заговора и многие другие могут быть использованы для выявления причинного гена, вызывающего фенотип интереса. Учитывая применимость этого метода, он может быть использован не только на растениях модели Arabidopsis, но и другие модели растений тоже при условии, что фенотип интереса считывания могут быть созданы.
