Количественная оценка атеросклеротических поражений у апоЭ и других типов гиперлипидемических мышей является ключом к оценке различных генетических факторов и новых методов лечения. Наш протокол предоставляет пошаговые инструкции по качественному и количественному анализу атеросклеротической нагрузки за одну мышь. Через 16 недель после индуцирования атеросклероза, перед перфузией сердца, нагрузите 10-миллилитровый шприц 10 миллилитрами DPBS и прикрепите иглу 25 калибра.
Поднимите брюшную кожу экспериментальной мыши пинцетом и используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать кожу от основания живота до верхней части шеи. Откройте брюшную стенку ниже грудной клетки и используйте пинцет, чтобы поднять грудину для доступа к диафрагме. Отрежьте диафрагму и отрежьте грудную клетку, чтобы обнажить грудную полость.
Далее делают небольшой разрез в правом предсердии сердца и медленно вводят весь объем DPBS в апикальную пункцию левого желудочка. Печень и почки станут светло-коричневого цвета. Когда весь физиологический раствор будет перфузирован, используйте нетканую губку, чтобы очистить грудную полость от любой посторонней крови и жидкости.
После того, как грудная полость была протерта, удалите неэкспериментальные органы и срежьте ключицу пинцетом и тонкими ножницами. Поместите мышь под стереомикроскоп и используйте пинцет и пружинные ножницы для рассечения аорты. Когда аорта была выделена, накройте ткань пропитанной физиологическим раствором нетканой губкой и рассекните ветви аорты, включая брахиоцефальные, сонные, подключичные, почечные, общие подвздошные и бедренные артерии.
Когда все артерии, ответвляющиеся от аорты, будут изолированы, используйте пинцет и пружинные ножницы, чтобы тщательно рассечь и удалить адвентитную жировую и соединительную ткань вокруг ветвей аорты и аорты. Успешная изоляция аорты и ветвей аорты требует практики и терпения. Чтобы зафиксировать сосудистое дерево, сначала загрузите 10-миллилитровый шприц с 4%-ным формальдегидом в 1X DPBS и прикрепите иглу 25-го калибра.
Не забывайте всегда готовить 4% формальдегида внутри вытяжки. Вставьте иглу в апикальный прокол левого желудочка и медленно введите весь объем фиксатора. Очистите грудную полость от любых посторонних жидкостей нетканой губкой, как показано на рисунке, и используйте пинцет и микродискалирующие пружинные ножницы, чтобы отделить сердце от аорты.
Когда ткани были разделены, изолируйте и иссекайте аорту и ее главный сосуд от одного миллиметра над сонной артерией до конца бедренной артерии и поместите сосуд в контейнер DPBS. Для окрашивания неоткрытой всей аорты Oil Red O используйте штифты Minutien, чтобы закрепить сосуд на восковой чашке Петри и промыть сосуд свежими DPBS. Налейте в посуду 25 миллилитров свежего 0,45 микрометра фильтрованного пористого раствора Oil Red O для 60-минутного окрашивания при комнатной температуре.
Погрузите ткань 60% изопропанолом для 20-минутной стирки при комнатной температуре. В конце инкубации промыть сосуд три раза свежей дистиллированной водой в течение пяти минут на каждую стирку и поместить посуду под рассекающий микроскоп. Используйте пинцет и пружинные ножницы, чтобы аккуратно очистить всю периваскулярную жировую ткань вокруг аорты, чтобы избежать ложного фонового окрашивания Oil Red O и перенести сосуд на чистый стеклянный предмет микроскопа.
Oil Red O помечает богатый липидами бляшок красным, оставляя области, не содержащие бляшек, бледными по цвету. Затем получите цифровые микроснимки высокого разрешения с помощью светового микроскопа, оснащенного камерой, и сохраните изображения предпочтительно в формате файла изображения с тегами. Для крепления образца ткани аорты перенесите сосуд на восковую чашку Петри и накройте ткань свежим DPBS.
Разрыв сонных и подключичных артерий дуги аорты и подвздошных артерий в брюшной аорте на один-два миллиметра после бифуркации. Разрыв почечных артерий. Затем используйте микродиссекционные пружинные ножницы, чтобы продольно открыть препарат аорты вдоль внутренней кривизны и подвздошных артерий и разрезать три ветви дуги аорты вдоль большей кривизны до базового уровня внутренней кривизны.
Затем используйте булавки Minutien, чтобы закрепить аорту плоской на блюде, не растягиваясь просветной стороной вверх, и накройте ткань свежим DPBS. По сравнению с аполипопротеиновыми Е нокаутными мышами, стенки аорты гладкомышечных клеток TGF-бета-R2 нокаутируют аполипопротеин Е мышей демонстрируют тяжелый атеросклероз, что затрудняет рассечение поражений. Кроме того, аневризмы особенно обширны ниже надпочечниковой аорты, сильно напоминая запущенные аневризмы аорты человека.
Здесь показано репрезентативное изображение неоткрытой аорты от мыши с высоким содержанием холестерина и высоким содержанием жиров, подпитываемой TGF-бета-R2 нокаутирующим аполипопротеином E, окрашенной маслом Red O. У мыши развилась как восходящая, так и брюшная аневризма аорты с ускоренным образованием атеросклеротического поражения, наблюдаемого в брахиоцефальной, сонной, подключичной, подвздошной, бедренной и почечной артериях. Это окрашивание маслом Red O нокаутирующей ткани мыши TGF-beta-R2 аполипопротеина E показывает тяжелое аневризматическое увеличение и заметное удлинение всей аорты по сравнению с группой нокаутирующих мышей аполипопротеина E.
Важно уметь отличать окрашенные Oil Red O бляшки от ложного фона Oil Red O окрашенных периваскулярных жировых тканей. Бляшки атеросклероза являются трехмерными явлениями. После количественной оценки 2D-поражения аорты лица мы рекомендуем анализ набора бляшек, таких как корни аорты и брахиоцефальная артерия.
Этот протокол также может быть использован для определения того, влияет ли конкретный генетический фактор, вмешательство или лечение на прогрессирование или регрессию атеросклероза в этих моделях.
