В этом протоколе мы описываем простой метод изготовления бумажного устройства под названием XO Pad, которое предназначено для эффективного обогащения в изоляции внеклеточных пузырьков. XO Pad является простым устройством, которое может предварительно сконцентрировать и изолировать внеклеточные пузырьки без использования каких-либо химических веществ или рабочих машин, показывая при этом более высокие темпы восстановления, чем обычные методы. Начните с определения региона, который будет напечатан с помощью программного обеспечения принтера.
Конструкция должна иметь 12 восковых узорчатых слоев, в которых диаметры круглых участков образца постепенно сужаются от пяти до двух миллиметров. Затем напечатайте гидрофобный воск на обозначенных регионах по обе стороны целлюлозной бумаги. Поместите воск печатной бумаги в лабораторной печи в течение 80 секунд при температуре 120 градусов по Цельсию, а затем сократить воск печатной бумаги с резаком, чтобы сделать отдельные устройства XO Pad.
Бросьте пять и два микролитера пермяки селективной мембраны на выборочные области в левом и правом большинстве слоев, соответственно. Поместите слои, закодированные с завивкой селективной мембраны на горячей пластине при 70 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы испарять растворитель. Затем запечатай внешнюю поверхность покрытого слоя лицом к буферу раствор чувствительной лентой, оставив небольшое отверстие.
Сложите устройство XO Pad взад и вперед вдоль белых линий, чтобы конвергентно соединить все области выборки. Pipette 15 микролитров микрозвука и экзосомы образца в конвергентных областях образца и ждать несколько секунд, чтобы обеспечить полное смачивания. Поместите две акриловые камеры на обоих концах XO Pad и зажим его надежно с небольшими зажимами связующего, чтобы предотвратить развертывание.
Заполните камеры 110 микролитров 0.1X PBS и вставьте два серебряных электрода. Затем используйте систему измерения источника напряжения, чтобы применить 30 вольт к электродам в течение 20 минут. Чтобы изолировать обогащенные микровезолы и экзосомы, отделить сложенный XO Pad от акриловых камер и развернуть устройство, чтобы изолировать обогащенные частицы от других слоев.
Удар из образцов областях в слоях восемь и девять, где микровеся и экзосомы обогащаются для анализа вниз по течению. Для оптимизации времени работы по максимальному восстановлению обогащенных частиц был проведен анализ замедленной миграции флуоресцентно помеченных микровезикул и экзосом. Флуоресценция интенсивности во всех областях выборки были количественно с ImageJ программного обеспечения.
Перед процессом обогащения микровезикулы и экзосомы рассеивались во всех выборочных областях с постепенным снижением интенсивности. После 10 минут обработки частицы мигрировали электрокинетически, и на слою 7 появилась мгновенная предприемная вилка. Когда время достигало 20 минут, микровеся и экзосомы были сильно сосредоточены на слоях восемь и девять и обогащены пять раз на основе интенсивности флуоресценции.
Целостность обогащенных микровезиков и экзосом в восьмом слое была исследована с помощью SEM. Значительно больше не поврежденных частиц наблюдалось после процесса обогащения. Было также проанализировано распределение размеров обогащенных микровесикул и экзосом.
Впоследствии была проанализирована фактическая концентрация обогащенных микровесикул и экзосом на участках образца в слоях 6, 8 и 10. В восьмом слое микровезикулы и экзосомы были предварительно сконцентрированы в 5,58, однако в других слоях не наблюдалось заметной предварительной концентрации. Чтобы обеспечить воспроизводимость этой процедуры, точно следовал протоколу для инкубации печи времени и температуры во время проверки устройства и времени работы устройства, потому что это оптимизированные условия.
XO Pad также может быть использован для отделять и изолировать внеклеточные пузырьки от богатых белком образцов, таких как сыворотка или плазма, с помощью карбонатного буфера. Этот протокол может обеспечить эффективный, простой инструмент подготовки, с его предварительной концентрации и изоляции возможностей, необходимых для клинических исследований, таких как диагностика, доставка лекарств, иммунотерапия, и другие терапевтические средства.
