בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לייצור מכשיר מבוסס נייר בשם XO Pad, המיועד להעשרה יעילה בבידוד של וריקולים חוץ-תאיים. ה- XO Pad הוא מכשיר פשוט שיכול לרכז ולבודד קדם-תאיים ללא שימוש בכימיקלים או במכונות עבודה, תוך הצגת שיעורי התאוששות גבוהים יותר מאשר שיטות קונבנציונליות. התחל בהגדרת האזור להדפסה באמצעות תוכנת מדפסת.
העיצוב צריך להיות 12 שכבות בדוגמת שעווה שבו קטרים של אזורי מדגם עגולים בהדרגה צר מחמישה עד שני מילימטרים. לאחר מכן, להדפיס שעווה הידרופובית על האזורים המיועדים משני צידי נייר תאית. מניחים את הנייר המודפס שעווה בתנור מעבדה במשך 80 שניות ב 120 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לחתוך את הנייר המודפס שעווה עם חותך כדי להפוך התקנים בודדים XO Pad.
זרוק חמישה ושני microliters של קרום סלקטיבי פרם על אזורי המדגם ברוב השכבות השמאלית וי הימנית ביותר, בהתאמה. מניחים את השכבות מקודדות עם קרום סלקטיבי סלם על צלחת חמה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להתאדות את הממס. לאחר מכן לאטום את המשטח החיצוני ביותר של השכבה מצופה מול פתרון החיץ עם סרט רגיש ללחץ, עוזב חור קטן.
מקפלים את התקן XO Pad הלוך ושוב לאורך הקווים הלבנים כדי לחבר את כל אזורי המדגם. פיפטה 15 מיקרוליטרים של מיקרובסיקל מדגם exosome באזורים מדגם מתכנס לחכות כמה שניות כדי להבטיח הרטבה מלאה. מניחים שני תאים אקריליים בשני הקצוות של כרית ה- XO ומהדקים אותו בצורה מאובטחת עם קליפי קלסר קטנים כדי למנוע את ההתגלות.
מלאו את התאים ב-110 מיקרוליטרים של 0.1X PBS והכניסו שתי אלקטרודות כסף. לאחר מכן השתמש במערכת מדידת מקור מתח זרם כדי להחיל 30 וולט על האלקטרודות במשך 20 דקות. כדי לבודד את המיקרוווסיקים והאקסוזומים המועשרים, הפרד את כרית ה- XO המקופלת מהתאיים האקריליים ופרש את המכשיר כדי לבודד את החלקיקים המועשרים מהשכבות האחרות.
אגרוף את אזורי המדגם בשכבות שמונה ותשע שבו microvesicles ו exosomes מועשרים לניתוח במורד הזרם. בדיקה של נדידת זמן-לשגות של מיקרואורגניזמים ואקסוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית בוצעה על מנת לייעל את זמן הפעולה להתאוששות מרבית של החלקיקים המועשרים. התעצמויות הפלואורסצנטיות בכל אזורי המדגם כומתו באמצעות תוכנת ImageJ.
לפני תהליך ההעשרה, מיקרואורגניזמים ואקסוזומים פוזרו בכל אזורי המדגם עם ירידה הדרגתית בעוצמה. לאחר 10 דקות של עיבוד, החלקיקים היגרו אלקטרו-קינטית ותקע טרום ריכוז מיידי הופיע בשכבה שבע. כשהגיע הזמן ל-20 דקות, מיקרואורגניזמים ואקסוזומים התמקדו מאוד בשכבות 8 ו-9 והועשרו פי חמישה על סמך התעצמות הפלואורסצנטיות.
שלמות המיקרואורגניזמים והאקסוזומים המועשרים בשכבה 8 נחקרה עם SEM. באופן משמעותי יותר חלקיקים שאינם פגומים נצפו לאחר תהליך ההעשרה. כמו כן נותחה התפלגות הגודל של המיקרואורגניזמים והאקסוזומים המועשרים.
לאחר מכן, הריכוז בפועל של המיקרואורגניזמים המועשרים והאקסוזומים באזורי המדגם בשכבות 6, 8 ו-10 נותח. בשכבה 8, המיקרואורגניזמים והאקסוזומים התרכזו מראש בגורם של 5.58, אך בשכבות האחרות לא נצפה ריכוז מקדים מורגש. כדי להבטיח את יכולת ההתרבות של הליך זה, פעל במדויק את הפרוטוקול עבור זמן הדגירה בתנור וטמפרטורה במהלך אימות המכשיר וזמן הפעולה של המכשיר מכיוון ואלהים הם התנאים הממוטבים.
ניתן להשתמש ב- XO Pad גם כדי להפריד ולבודד קבוצה חוץ-תאית מדגימות עשירות בחלבון, כגון סרום או פלזמה, באמצעות מאגר פחמתי. פרוטוקול זה יכול לספק כלי הכנה יעיל ופשוט, עם יכולות טרום ריכוז ובודד הנדרשות למחקר קליני, כגון אבחון, אספקת תרופות, אימונותרפיה וטיפולים אחרים.
