このプロトコルでは、細胞外小胞を分離して効果的な濃縮のために設計されたXO Padと呼ばれる紙ベースのデバイスを製造する簡単な方法を説明する。XO Padは、従来の方法よりも高い回収率を示しながら、化学物質や作業機械を使用せずに細胞外小胞を事前濃縮し、単離することができるシンプルなデバイスです。まず、印刷する領域をプリンタ ソフトウェアで定義します。
設計は、円形のサンプル領域の直径が徐々に5ミリメートルから2ミリメートルに狭い12のワックスパターンの層を持っている必要があります。次に、セルロース紙の両側の指定領域に疎水性ワックスを印刷する。ワックスプリント紙を120°Cで80秒間実験室のオーブンに入れ、ワックスプリント紙をカッターで切って個々のXOパッドデバイスを作ります。
5マイクロリットルと2マイクロリットルのパーマ選択的膜を、最も左と右のほとんどの層のサンプル領域にそれぞれ落とします。パーマ選択膜でコード化された層をホットプレートの上に摂氏70度で30分間置き、溶媒を蒸発させます。次に、緩衝液に面したコーティングされた層の最表面を感圧テープで密封し、小さな穴を残します。
XO Pad デバイスを白線に沿って前後に折り、すべてのサンプル領域を収束的に接続します。収束サンプル領域のミクロベシクルおよびエキソソームサンプルのピペット15マイクロリットルを、完全な湿潤を確実にするために数秒待ちます。XOパッドの両端に2つのアクリルチャンバーを置き、展開を防ぐために小さなバインダークリップでしっかりとクランプします。
0.1X PBSの110マイクロリットルでチャンバーを充填し、2つの銀電極を挿入します。次に、電流電圧源測定システムを使用して、30ボルトを電極に20分間塗布します。濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを分離するには、折り畳まれたXOパッドをアクリルチャンバーから分離し、デバイスを展開して濃縮された粒子を他の層から分離します。
マイクロベシクルとエキソソームが下流解析のために濃縮されるレイヤー 8 と 9 のサンプル領域をパンチアウトします。蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス移行アッセイを実施し、濃縮粒子の最大回収のための動作時間を最適化した。全てのサンプル領域の蛍光強度をImageJソフトウェアで定量化した。
濃縮プロセスの前に、マイクロベシクルおよびエキソソームは、強度の緩やかな減少を伴うすべてのサンプル領域に分散した。10分間の処理の後、粒子は電気キネテニックに移動し、即刻の事前濃度プラグが層7に現れた。20分に達すると、マイクロベシクルとエキソソームは8層と9層に強く焦点を当て、蛍光強度に基づいて5倍に濃縮された。
8層の濃縮された微小胞およびエキソソームの完全性をSEMで調べた。濃縮された微小胞およびエキソソームのサイズ分布も分析した。
続いて、6層、8層、10層のサンプル領域上の濃縮された微小胞およびエキソソームの実際の濃度を分析した。層8では、ミクロベシクルとエキソソームは5.58倍の予め濃縮されたが、他の層では顕著な前濃度は認められなかった。この手順の再現性を確保するために、デバイス検証時およびデバイスの動作時間が最適化された条件であるため、オーブンインキュベーション時間と温度のプロトコルに正確に従った。
XOパッドは、炭酸塩バッファーを使用して、血清や血漿などのタンパク質が豊富なサンプルから細胞外小胞を分離および分離するためにも使用できます。このプロトコルは、診断、薬物送達、免疫療法、および他の治療などの臨床研究に必要な濃縮および分離機能を備えた効率的で簡単な準備ツールを提供することができます。
